丁酸梭菌對水產(chǎn)動物營養(yǎng)及免疫研究進(jìn)展

李芳源，王常安，劉紅柏

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210000）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，能提高水產(chǎn)動物生長性能或者預(yù)防、治療疾病的功能性飼料添加劑備受養(yǎng)殖者的青睞[1]。在多種功能性添加劑中，抗生素的使用比例遠(yuǎn)高于其他添加劑。抗生素可顯著提高水產(chǎn)品的產(chǎn)量，降低養(yǎng)殖成本[2]，但是，抗生素的細(xì)菌耐藥性與抗生素殘留關(guān)系到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和人類健康[3]。

2003 年，歐盟（EU）在（EC）1831/2003 號條例中指出：“除抗球蟲藥或單抗藥物外，抗生素不得作為飼料添加劑”[4]。這一禁令使科學(xué)界迫切尋找減少抗生素使用的替代品，而最具潛力的飼料添加劑之一就是益生菌。1986 年Kozasa[5]首次將益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，van Doan 等[4]對益生菌重新定義“益生菌最初是從飼喂宿主的水或宿主的胃腸道中分離出來的，能夠改善宿主的生長和健康”。丁酸梭菌Clostridium butyricum 作為一種益生菌，很早便被國外學(xué)者關(guān)注，而我國對丁酸梭菌的研究起步較晚。農(nóng)業(yè)部于2009 年7 月將丁酸梭菌制劑列為微生物飼料添加劑用于畜禽養(yǎng)殖。由于丁酸梭菌或其代謝產(chǎn)物能夠改變腸道的菌群結(jié)構(gòu)，提高腸道中消化酶、淀粉酶等酶的活性和腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)中的細(xì)胞因子或影響免疫反應(yīng)的路徑來提高水產(chǎn)動物腸道的抗炎能力[6]，近年來其應(yīng)用受到關(guān)注，廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。

1 丁酸梭菌簡述

1.1 理化性質(zhì)

丁酸梭菌是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢桿菌[7]。菌體常單個或多個存在，兩端鈍圓，周身鞭毛，具有運動性[8]。該菌分布廣泛，既可存活于土壤中，也可存活在人和動物的腸道中，是一種常見的人和動物腸道共生細(xì)菌。該菌能產(chǎn)生內(nèi)生孢子，對環(huán)境有較好的抗逆性；耐腸胃消化液，最適生長pH 為7.2；廣溫性，在100℃加熱5 min 不失活，37℃下生長最適，可在室溫條件下保存[9]。

1.2 生物學(xué)特性

丁酸梭菌能夠利用大腸中未消化的碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生丁酸、乙酸等短鏈脂肪酸。短鏈脂肪酸是腸上皮細(xì)胞的重要營養(yǎng)物質(zhì)，除了能夠維持腸上皮結(jié)構(gòu)的完整性，還能為腸道提供酸性環(huán)境，抑制腸道有害菌的生長[10]。丁酸梭菌能夠分泌消化酶、等促進(jìn)腸道消化；能夠提高腸道的免疫能力，治療腸道某些疾病[11]。丁酸梭菌的另一特點是對大部分抗生素具有抗性[12]。

2 丁酸梭菌對水產(chǎn)動物生長性能的影響

近年來，對益生菌的各種功效研究受到廣泛關(guān)注，并證實了它們能夠影響水產(chǎn)動物的生長性能和健康水平[3]。樊英等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中單獨和聯(lián)合添加丁酸梭菌及凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans，虹鱒Oncorhynchus mykiss 的特定生長率和粗蛋白含量均高于對照組。Li 等[14]在飼料中添加不同濃度的丁酸梭菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅非魚Oreochromis niloticus 的特定生長率隨丁酸梭菌濃度的增加而增加，最佳劑量為1×105CFU·g-1。類似的結(jié)果在凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei[6,15]、斑節(jié)對蝦Penaeus monodon[16]、Miichthys miiuy[17]、鰻鱺Anguilla japonica[18]和銀鯧Pampus argenteus[19]等研究中得到進(jìn)一步驗證。丁酸梭菌一般在水產(chǎn)動物的腸道中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，提高飼料營養(yǎng)性能，發(fā)酵生成可溶性單糖、氨基酸等有機(jī)物，進(jìn)入細(xì)胞后被吸收利用，能提高水產(chǎn)動物腸道對營養(yǎng)的吸收能力，促進(jìn)動物生長[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可作為水質(zhì)改良劑，改善水環(huán)境，降低水產(chǎn)動物的發(fā)病率和死亡率。

3 丁酸梭菌對水產(chǎn)動物腸道健康的影響

3.1 腸道酶活性的影響

丁酸梭菌可產(chǎn)生脂肪酶、淀粉酶等消化酶，能消除部分抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響[21]。Foysal 等[22]給螯蝦Cherax cainii 飼喂丁酸梭菌后，血淋巴中的溶菌酶活性提高。Mohammad 等[23]發(fā)現(xiàn)，益生菌能夠提高里海鱒Salmo trutta caspius 腸道內(nèi)溶菌酶的活性。多種益生菌混合能提高里海白魚Rutilus frisii kutum幼魚皮膚粘液中的溶菌酶[24]及堿性磷酸酶（ALP）和蛋白酶的酶活性。Valipour 等[25]給窄指河螯蝦Astacus leptodactylus飼喂含有濃度為107CFU·g-1、108CFU·g-1和109CFU·g-1植物乳桿菌Lactobacillus plantarum 的飼料，發(fā)現(xiàn)其蛋白酶、淀粉酶和ALP 活性升高。在鯉Cyprinus carpio、牙鲆Paralichthys olivaceus 和虹鱒的研究中也得到類似的結(jié)果[26,27]。Pan等[28]發(fā)現(xiàn)：丁酸梭菌能夠降低小鼠因急性胰腺炎而過度升高的血清淀粉酶和脂肪酶活性。在凡納濱對蝦的研究中也有類似報道[29]。

3.2 腸道菌群的影響

腸道菌群可在宿主體內(nèi)形成穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，機(jī)體某些疾病的發(fā)生與菌群失調(diào)或腸道微生物組成異常有關(guān)[30]。腸道菌群失衡將打破機(jī)體的平衡，外界有害菌或自身有害菌將大量增殖，發(fā)生各種疾病，因此，維持腸道菌群穩(wěn)定十分重要。Li 等[31]用無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae，GBS）攻毒羅非魚后，在日糧中添加丁酸梭菌（1×105CFU·g-1、1×106CFU·g-1和1×107CFU·g-1）探究其是否具有抑菌作用。結(jié)果顯示：丁酸梭菌能降低羅非魚的累計死亡率。Pan 等[32]給攻毒鰻弧菌Vibrio anguillarum 或嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila 后，在飼料中分別添加活的及滅活的丁酸梭菌，結(jié)果與未添加丁酸梭菌攻毒組相比，添加活菌及滅活菌的攻毒組死亡率均降低。樊英等[12]在研究丁酸梭菌對虹鱒腸道菌群的影響實驗中也得到了類似的結(jié)果。Rimoldi 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂添加了益生元的飼料后，歐洲鱸Dicentrarchus labrax 的弧菌數(shù)量也減少。日糧中添加丁酸梭菌在對凡納濱對蝦[29]中發(fā)現(xiàn)減少了潛在的腸道病原體數(shù)量，增加了有益的細(xì)菌。這可能是由于丁酸梭菌產(chǎn)生了丁酸、乙酸等酸性物質(zhì)，使腸道pH 降低，抑制不耐酸致病菌如大腸桿菌Escherichia coli、沙門氏菌Salmonella、弧菌Vibrio等的生長，并且能夠與致病菌粘附，抑制其在魚腸上皮細(xì)胞定植，也大大減少了腸道內(nèi)的致病菌數(shù)量[34,35]，促進(jìn)了腸道有益菌的生長[36]。丁酸梭菌產(chǎn)生的脂肪酸能夠與膽汁酸結(jié)合，共同抵抗致病菌產(chǎn)生的毒素。

3.3 腸道結(jié)構(gòu)的影響

腸道結(jié)構(gòu)的完整性直接影響機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用及各種生理活動。腸道中絨毛的長度和隱窩的深度是腸道功能重要的形態(tài)學(xué)參數(shù)，小腸絨毛長度增加能夠促進(jìn)消化吸收，隱窩深度變淺有利于腸上皮細(xì)胞的發(fā)育。腸道絨毛長度、隱窩深度比值能高效反映機(jī)體的消化吸收能力[37]。潘曉東[38]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂丁酸梭菌后，腸道絨毛、微絨毛的高度明顯增加。鄭有秀等[39]發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能夠使斷奶仔豬的空腸絨毛高度/隱窩深度顯著或極顯著高于對照組。楊明月等[40]研究丁酸梭菌對獺兔Rex rabbit的腸道性能影響時，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，試驗組中小腸組織絨毛長度極顯著或顯著升高，試驗組十二指腸、空腸及回腸絨毛/隱窩比值不同程度高于對照組。結(jié)果表明：丁酸梭菌能夠提高腸道對營養(yǎng)吸收作用的機(jī)理可能是丁酸梭菌促進(jìn)了腸道絨毛的發(fā)育。

二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）是調(diào)節(jié)組織（如骨髓和腸粘膜）迅速增殖的一種酶，其功能是將幾種多胺氧化脫氨，這是細(xì)胞增殖所必需的物質(zhì)。DAO 主要位于小腸粘膜，特別是在絨毛尖端附近，腸粘膜損害會導(dǎo)致DAO 從小腸絨毛尖端滲入循環(huán)系統(tǒng)，因此，DAO 是反映了小腸完整性和成熟度的腸粘膜屏障指標(biāo)[41]。先前的研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加丁酸梭菌可以降低羅非魚[31]、肉雞[19]和仔豬[42]血清的DAO 含量。因此，該菌會影響腸道的結(jié)構(gòu)完整性，但作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.4 腸道免疫能力的影響

很多研究證明益生菌可以刺激免疫反應(yīng)[43]。骨髓分化初級反應(yīng)蛋白88（MyD88）是Toll 樣受體（TLR）信號通路的一個關(guān)鍵接頭蛋白，在傳遞信息和固有免疫中有重要作用，通路對益生菌的識別和腸道免疫系統(tǒng)的激活起著重要作用[44]。丁酸梭菌參與免疫反應(yīng)需要TLR2 受體的識別，TLR2 常通過MyD88 向核因子κB（NF-κB）發(fā)出信號，產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子[45]。丁酸梭菌也可在發(fā)炎的粘膜中通過TLR2/MyD88 信號通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，治療結(jié)腸炎[46]。石斑魚Epinephelus sp.腸道原籍嗜冷桿菌SE6 作為益生菌增加了腸道TLR2 和MyD88的基因表達(dá)[44]。Li 等[31]發(fā)現(xiàn)，在飼料中補(bǔ)充丁酸梭菌后，羅非魚腸道中TNF-α 和IL-8 的基因表達(dá)增加。Xiao 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌能夠降低患有急性胰腺炎的黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco 中IL-8的表達(dá)，提高IL-10 的表達(dá)。丁酸梭菌可能會促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。用乳酸菌Lactobacillus sp.菌株飼喂鯉后促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-12）和抗炎細(xì)胞因子（IL-10）基因的表達(dá)[48]，提高了虹鱒[49]和石斑魚[44]腸中IL-8 的基因表達(dá)及雜交羅非魚（Oreochromis niloticus × O.aureus）小腸中TNF-α 的表達(dá)[50]。可見，益生菌能夠通過增加促炎細(xì)胞因子（如IL-8，IL-6 和TNF-α）來誘導(dǎo)宿主的致敏作用；通過合成抗炎細(xì)胞因子（如IL-10）為宿主提供有益的作用。

病原微生物可通過多條途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，激活后的補(bǔ)體系統(tǒng)可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力。魚類中的補(bǔ)體C3 和C4 在抵抗細(xì)菌病原體方面起重要作用。研究表明，益生菌乳酸球菌lactococcus lactis[51]和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）[52]可以提高魚的血清補(bǔ)體成分水平。Gong 等[53]發(fā)現(xiàn)，戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus 作為乳酸菌的一種能使草魚Ctenopharyngodon idella 肝臟和脾臟中IgM和C3 補(bǔ)體蛋白基因的表達(dá)升高。在Li 等[31]人的實驗中也發(fā)現(xiàn)用添加了丁酸梭菌的飼料飼喂羅非魚，提高了血清中C3 和C4 的濃度。丁酸梭菌及乳酸菌提高補(bǔ)體分子的濃度可能與革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖有關(guān)[43]。脂多糖能通過替代激活途徑激活C3，有助于吞噬細(xì)胞對病菌的吞噬，提高免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用。

丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸對維持結(jié)腸上皮的抗氧化能力有重要作用。葉海斌等[54]在虹鱒日糧中添加丁酸梭菌及凝結(jié)芽孢桿菌探究益生菌對虹鱒抗氧化能力的影響。結(jié)果顯示：兩種有益菌單一使用或聯(lián)合使用能有效提高虹鱒血清中總抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低丙二醛（MDA）的含量。Hasan 等[55]發(fā)現(xiàn)，添加益生菌后，牙鲆SOD 活性升高。同樣，益生菌會增加日本鰻Anguilla japonica[56]、紅鯛Pagrus major[57]、鯉[58]等體內(nèi)SOD 和CAT 的活性。這些實驗結(jié)果表明：丁酸梭菌作為益生菌能夠提高水產(chǎn)動物的抗氧化能力，這可能與其產(chǎn)生的丁酸和NADH 等物質(zhì)有關(guān)[59]。

4 丁酸梭菌在水產(chǎn)動物中的使用方法及安全問題

水產(chǎn)動物飼料中添加丁酸梭菌可通過提高腸道性能來維持動物的健康。因此，探究丁酸梭菌的使用方法及最適添加劑量十分重要。經(jīng)分離得到的丁酸梭菌經(jīng)過發(fā)酵、添加保護(hù)劑、噴霧干燥最終制成制劑；在實驗研究中，將不同濃度的丁酸梭菌制劑與基礎(chǔ)日糧飼料混合后用于飼喂水產(chǎn)動物[60]。在不同種類魚、蝦的實驗中，由于發(fā)酵技術(shù)的限制，多數(shù)將丁酸梭菌的濃度梯度設(shè)在103～109CFU·g-1之間，少數(shù)實驗用菌種發(fā)酵噴霧干燥后活菌數(shù)可達(dá)1010CFU·g-1[61]。與未添加丁酸梭菌的對照組相比，多數(shù)添加了丁酸梭菌的水產(chǎn)動物生長性能及腸道性能均有所提升，且無副作用，108～109CFU·g-1可作為最適添加量[12,16,32,38]，結(jié)合丁酸梭菌在體外的發(fā)酵過程，推測高比例的丁酸梭菌在腸道內(nèi)發(fā)酵可能對水產(chǎn)動物有不利影響。高濃度的丁酸梭菌在腸道中發(fā)酵時會通過多個途徑大量產(chǎn)生丙酮酸、丁酸等酸性物質(zhì)，降低腸道pH，導(dǎo)致腸道發(fā)生酸脅迫現(xiàn)象，反而降低腸道中丁酸梭菌有效活菌數(shù)，代謝產(chǎn)物也降低，打破腸道原有的平衡。丁酸梭菌也有可能過度發(fā)酵葡萄糖，形成芽孢，進(jìn)而降低發(fā)酵密度[61]。

5 存在問題

5.1 菌株選育

丁酸梭菌分離鑒定操作繁瑣，不同廠家選育出的菌株其質(zhì)量參差不齊，后期菌種發(fā)酵獲得的產(chǎn)品質(zhì)量不同，在水產(chǎn)動物中的效果也會有所差異。

5.2 水中可保存性

丁酸梭菌作為水產(chǎn)飼料添加劑，應(yīng)具備不溶于水且易被腸道吸收的性能。目前最新研究的微膠囊化包囊技術(shù)已能解決腸溶性的問題，但丁酸梭菌制劑在水中的有效時限問題還未解決。

5.3 與抗生素或其他菌種聯(lián)合使用的配比

丁酸梭菌能與多種抗生素聯(lián)合使用來治療水產(chǎn)動物的某些腸道疾病，也能與其他益生菌聯(lián)合使用共同提高水產(chǎn)動物的腸道性能，但丁酸梭菌、抗生素、其他益生菌三者的最佳配比卻很少有人研究。

5.4 在水產(chǎn)動物中的使用及腸道作用機(jī)制

目前的研究驗證了丁酸梭菌對水產(chǎn)動物的有益作用，但對于不同劑量的使用效果研究較少，以后應(yīng)研究丁酸梭菌在水產(chǎn)動物各個生長階段的適宜使用劑量。對丁酸梭菌的腸道作用機(jī)制研究多傾向于家畜動物，在水產(chǎn)動物中研究較少。丁酸梭菌對水產(chǎn)動物腸道免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用是否與家畜一致還需進(jìn)一步驗證。

6 展望

丁酸梭菌可抑制嗜水氣單胞菌、魯氏耶爾森氏菌等病原菌，可作為添加劑，既能改良水質(zhì)，也能提高水產(chǎn)動物的抗病能力。與其他研究較多的益生菌（乳酸菌、雙歧桿菌等）相比，丁酸梭菌具有芽孢，性能穩(wěn)定，耐高溫，可長期保存，耐酸等優(yōu)點，可到達(dá)水產(chǎn)動物腸道發(fā)揮其功能。今后的研究應(yīng)集中水產(chǎn)動物在不同生長階段的最佳使用劑量、改良菌株選育技術(shù)及提高丁酸梭菌制劑中活菌在水中的存活時間等方面。