一種通用型生物解脂劑的制備

張瓊月，熊 躍，李冰寒，李林輝

(西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637009)

隨著人們生活水平的不斷改善，餐飲行業也隨之欣欣向榮，但相關產業背后產生的油脂廢水也不斷增加。據統計，我國中大型城市每天產生的油脂廢水可高達300多萬t[1]，加之不正當、不合理的污水處理與廢水排放，不合法的油脂廢水回收再利用，對社會環境與生態環境、食品安全甚至人類安全都造成了極大的威脅[2-3]，油脂廢水的合規處理與合理回收利用也成為社會各界關注的重點。

當下看來，處理油脂廢水的主流方式包括物理法、化學法和生物法[4]三大類。其中物理法和化學法由于投資較大、占地面積廣、流程復雜、且容易產生二次污染等不足，實際應用于大規模處理油脂廢水的情況較少；而生物法因其處理過程成本低、效率高，且不產生二次污染等優點而深受業內人士青睞[5-6]。簡言之，生物法處理油脂廢水，即利用具有油脂降解能力的微生物，將油脂作為其生長發育所必需的碳源和能源，通過微生物生長過程中產生的脂肪酶等降解酶系，先將油脂初步水解為甘油、脂肪酸，最終分解氧化為無污染的水、二氧化碳等代謝產物，達到快速便捷分解處理油脂且不造成二次污染的最終目的。經過學者大量的篩選和驗證實驗可知[7-8]，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一類具有分解油脂能力、分布廣泛的微生物，常見于土壤、灰塵和污水當中[9]。蠟樣芽孢桿菌能產生大量芽孢以抵御不良生長條件，環境合適時，芽孢又能快速萌發形成成熟的桿菌，產生大量脂肪酶分解利用環境中的脂類以滿足生命活動所需。基于此種特性，蠟樣芽胞桿菌滿足制備干燥解脂劑所需要的保存時間久、活性恢復快、產物安全、無二次污染等一系列要求。

本文將實驗室前期鑒定并保存的蠟樣芽胞桿菌進行活化，在測定菌株解脂能力之后，制備成為具有高脂肪酶活性的解脂劑，在使用時只需要將解脂劑進行快速活化便可以大量投入使用，快速有效地降低油脂廢水所帶來的種種危害。本研究所關注的解脂微生物制劑的研究與制備，對于處理油脂廢水、生態環境保護及其相關問題具有重要且深刻的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 實驗室保存的蠟樣芽胞桿菌4號、7號。

1.1.2 培養基 LB固體培養基、LB液體培養基、解脂培養基(以10%體積的菜籽油替代LB液體培養基中的蛋白胨，且pH值調節至7.0)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株解脂能力探究 將蠟樣芽胞桿菌4號、7號菌株分別接種于LB固體培養基上，30℃活化培養；再轉接至LB液體培養基中，以30℃、140r/min進行擴大培養。當測得菌株OD600值為0.3～0.6時[10]，分別接種1mL菌液于100mL解脂培養基中，30℃、140r/min振蕩培養1d。觀察對比上層油脂顏色變化，油脂顏色越淺說明菌株的解脂能力越強，選擇解脂能力更強的菌株進行后續配制解脂劑的試驗。

1.2.2 解脂劑配方篩選 干劑制備。將麩皮、谷殼按重量比10∶1的比例配制，調水至100%～120%，再分別添加重量比例為調水后麩皮谷殼重量1%、2%、3%、5%、10%的純菜籽油進行攪拌并混合均勻。培養料以50g每份進行分裝，121℃滅菌20min，冷卻后用OD600值為0.3～0.6的菌液按0.1mL/g的比例進行接種，30℃恒溫培養，期間每12h將培養料混勻1次，每24h取樣檢測脂肪酶活力，直至培養結束。培養完成后將培養料于40℃下烘干至恒重，密封避光保存備用即可。脂肪酶活力測定[11]。取1g培養料用無菌水振蕩洗脫以獲取酶液，采用指示劑滴定法測定其中脂肪酶的活力，計算公式如下[12]：U=(V-V0)/15×50×n其中U為樣品的酶活力(u/g)；V為滴定樣品時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積(mL)；V0為滴定空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積(mL)；n為稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 菌株解脂能力的初步判定

與空白對照組上層分布均勻的金黃色油脂相比，實驗組上層油脂變為淺黃色，且下層培養基變渾濁。顏色的差異表明實驗組的部分油脂被消耗，證明具有解脂能力的蠟樣芽胞桿菌在培養過程中產生脂肪酶并分解了油脂，并且接種4號菌株的上層油脂顏色更淺，油脂被分解得更加充分，說明4號菌株的解脂能力強于7號菌株，故后續采用蠟樣芽胞桿菌4號菌株進行解脂劑的制備。

圖1 脂肪酶活力的測定結果

2.2 脂肪酶活性測定結果

根據測定結果來看，菜籽油的加入量為調水麩皮谷殼重量的5%時，解脂制劑的脂肪酶活性最為優異。從圖1可知，菜籽油添加量為5%和10%的情況下，從第1天到第6天蠟樣芽胞桿菌所產生脂肪酶的活性均呈現逐漸上升趨勢，最高可達4399u/g；而其余3個試驗組在培養5d后酶活便到達頂峰，雖耗時稍短但峰值較低，尚不足以達到制劑所需要的標準。總體來說，隨著菜籽油添加量比例的增加，其配方更有益于蠟樣芽胞桿菌生產脂肪酶，脂肪酶活性也越強；但分析可知，當油脂比例過高時，在一定程度上會影響菌株的生長，從而導致菌株產酶能力下降，故菜籽油添加量為10%時的總脂肪酶活力反而不如5%。

3 結論

解脂能力實驗結果表明，蠟樣芽胞桿菌具有解脂能力，且4號菌株更適宜用于制備解脂劑。添加不同比例菜籽油的配方實驗結果表示，采用麩皮、谷殼重量比10∶1并調水至100%～120%，再添加5%菜籽油的配方，接種OD600值為0.3～0.6的蠟樣芽胞桿菌菌液，在30℃下培養6d，再于40℃烘干至恒重，即可獲得具有高脂肪酶活性的解脂劑，其最高活力可達4399u/g。在脂肪酶活性測定的實驗中發現，油脂的添加在一定程度上可以促進解脂菌如蠟樣芽胞桿菌的生長，但油脂比例過高反而使得其產脂肪酶能力下降，這也使得我們加深了對適度一詞的理解。對環境的利用與保護也是緊緊聯系著適度二字，只有全心全意地保護環境，才能得到大自然的美麗饋贈。