淋巴細(xì)胞亞群對(duì)兒童EB病毒感染所致傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷意義

劉曉宇，王丹丹，呼嬋娟，張俊紅

EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）是皰疹病毒-4家族的成員之一[1]，是一種雙鏈DNA，具有親淋巴細(xì)胞性和親上皮細(xì)胞性。是由Epstein.Barr首次在非洲兒童Burkitt淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而得名[2]。是引起兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）的最主要病原之一[3]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示[4]，人群對(duì)EBV普遍易感，大部分人初次感染EBV是在兒童或青少年時(shí)期。在感染潛伏期，EB病毒主要附著于B淋巴細(xì)胞中，此時(shí)B細(xì)胞并不表達(dá)EB病毒核蛋白，不具有致病性[5]。EB病毒感染后，B細(xì)胞釋放出病毒顆粒，激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，釋放大量炎性因子，EB病毒從潛伏狀態(tài)變?yōu)樵鲋碃顟B(tài)。炎性反應(yīng)和免疫破壞協(xié)同作用可能是導(dǎo)致傳染性單核細(xì)胞增多癥預(yù)后不良的重要原因[6]。在不同免疫狀態(tài)下，有不同的臨床表現(xiàn)。感染發(fā)生后大多數(shù)人能通過(guò)機(jī)體對(duì)EBV特異的獲得性免疫反應(yīng)被控制為隱性感染，不發(fā)病。少數(shù)感染者會(huì)發(fā)生IM等急性感染表現(xiàn)，表現(xiàn)為發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大等[7-8]。雖然大部分感染者呈自限性，預(yù)后良好。但仍有少數(shù)患兒病情會(huì)出現(xiàn)進(jìn)展，發(fā)展為慢性活動(dòng)性EBV感染、EBV相關(guān)噬血細(xì)胞綜合征等[9]，導(dǎo)致不良預(yù)后，甚至危及患兒生命[10]。IM臨床表現(xiàn)不典型，涉及全身各系統(tǒng)。有研究認(rèn)為，EBV能導(dǎo)致T細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)度激活，導(dǎo)致免疫異常，病情發(fā)展與之密切相關(guān)。本研究檢測(cè)IM患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群變化，可能對(duì)及時(shí)診斷并掌握病情變化，為臨床診治提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2014年10月—2019年10月90例EBV感染致IM患兒作為病例組，男50例，女40例，年齡3～8歲，平均（5.7±1.4）歲；以年齡、性別配對(duì)的同期健康體檢兒童80人作為對(duì)照組，男48例，女32 例，年齡3～9歲，平均（6.1±1.6）歲；2組兒童年齡、性別構(gòu)成差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：病例組兒童符合IM診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，對(duì)照組兒童為來(lái)本院行健康體檢患兒，均無(wú)家族遺傳性疾病史，或小兒無(wú)急慢性疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①免疫缺陷性疾病或自身免疫性疾病者；②先天性生理缺陷或先天畸形；③入院前2周使用免疫調(diào)節(jié)劑及糖皮質(zhì)激素史；④淋巴癌、骨髓癌等惡性腫瘤。

1.3 IM診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]符合以下6項(xiàng)臨床指標(biāo)中任意3項(xiàng)，同時(shí)符合實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)任意1項(xiàng)。臨床指標(biāo)：①發(fā)熱；②頸淋巴結(jié)腫大；③咽、扁桃體炎；④肝大；⑤眼瞼水腫；⑥脾大。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：①抗EBV-病毒衣殼抗原（VCA）-IgM與抗EBV-VCA-IgG抗體陽(yáng)性，且抗EBV-核抗原（NA）-IgG抗體陰性；②抗EBV-VCAIgM陰性，但抗EBV-VCA-IgG抗體陽(yáng)性，且為低親和力抗體；③雙份血清EBV-VCA-IgG抗體滴度4倍以上升高；④外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)增多≥5.0×109/L，或異型淋巴細(xì)胞分?jǐn)?shù)≥0.10。

1.4 檢測(cè)方法 入組兒童均抽取清晨空腹靜脈血各2 ml，一份經(jīng)乙二胺四乙酸行抗凝處理 ，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血B淋巴細(xì)胞、CD3＋、CD4＋、CD8＋數(shù)量，通過(guò)CXP2.0 系統(tǒng)行圖像分析。同時(shí)入組的患兒進(jìn)行EB-DNA及EBV抗體的檢測(cè)，協(xié)助診斷。EBV-DNA＞102為陽(yáng)性。EBV-IgM檢測(cè)正常范圍0～3 AU/ml。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CD3＋、CD4＋、CD8＋數(shù)量等以±s表示，采用t檢驗(yàn)，性別構(gòu)成采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量比較 病例組CD3＋、CD8＋數(shù)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD4＋數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 2組外周血淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量比較

2.2 臨床癥狀 90例（100%）患兒均有不同程度發(fā)熱，頸部淋巴結(jié)腫大，扁桃體炎。27例（30.8%）患兒以雙眼瞼浮腫為首發(fā)癥狀，伴有鼻塞，打鼾。9例（10%）患兒出現(xiàn)丘疹、斑丘疹。脾腫大比較常見(jiàn)13例（14.4%），一般肋下可觸及。少數(shù)出現(xiàn)肝功能異常，白細(xì)胞減少。

3 討論

EBV是淋巴細(xì)胞雙鏈 DNA 病毒的一種[12]，傳播途徑主要是經(jīng)唾液傳播，人類(lèi)是其唯一的自然宿主。兒童及青少年人群是EBV的主要易感人群[13]，病情進(jìn)展多是在伴有遺傳缺陷、免疫抑制或潛伏感染反復(fù)激活的情況下發(fā)生。EBV感染以呼吸道感染和IM為多見(jiàn)，臨床可以表現(xiàn)為急性感染、肺炎、肝功能異常、甚至發(fā)展為慢性活動(dòng)性EB病毒感染、噬血細(xì)胞綜合征。典型傳染性單核細(xì)胞增多癥臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、咽扁桃體炎、頸部淋巴結(jié)腫大等。對(duì)于臨床表現(xiàn)不典型的患兒IM的診斷和治療增加了難度。此外肺炎支原體感染、巨細(xì)胞病毒感染也可以導(dǎo)致與IM相類(lèi)似的臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、頸部淋巴結(jié)腫大、咽峽炎三聯(lián)征。而且一旦感染EBV，病毒會(huì)終生攜帶。所以早期診斷尤為重要。機(jī)體不同免疫狀態(tài)感染EB病毒導(dǎo)致的IM的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后存在較大差異。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體免疫系統(tǒng)逐步完善，感染后增殖的細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈應(yīng)答。年長(zhǎng)兒IM發(fā)病率較嬰幼兒稍低，一般發(fā)展中國(guó)家兒童EBV感染有90%發(fā)生于6歲前[14]。

EBV主要感染B細(xì)胞，導(dǎo)致B細(xì)胞表面抗原發(fā)生改變，繼而引發(fā)T細(xì)胞防御反應(yīng)，CD4+T淋巴細(xì)胞是輔助T淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞內(nèi)分子發(fā)生磷酸化，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，通過(guò)一些細(xì)胞因子、輔助B細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等的激活，CD8＋T淋巴細(xì)胞就具有殺傷作用的細(xì)胞毒T細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）[15]。有文獻(xiàn)報(bào)道隨著EB病毒感染的進(jìn)展，攜帶EB病毒的B淋巴細(xì)胞在外周血中大量增殖，誘導(dǎo)機(jī)體固有的免疫應(yīng)答，清除大部分EB病毒陽(yáng)性B淋巴細(xì)胞[16]。部分逃避免疫攻擊的B淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，釋放病毒顆粒，EB病毒感染發(fā)展為急性期，逐漸出現(xiàn)臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、頸部淋巴結(jié)腫大、扁桃體炎、皮疹等。關(guān)于EB病毒逃避人體免疫攻擊的可能機(jī)制：在人體特定部位進(jìn)行復(fù)制；下調(diào)感染細(xì)胞表面的黏附因子或人類(lèi)白細(xì)胞抗原分子；無(wú)法識(shí)別病毒主要免疫表位突變以及標(biāo)為特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，下調(diào)感染細(xì)胞中病毒基因的表達(dá)。

本研究觀察外周血CD3＋、CD8＋水平，結(jié)果顯示，病例組CD3＋、CD8＋數(shù)量明顯高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明IM患兒CD3＋、CD8＋失衡，與祁正紅研究結(jié)果一致[6]。這可能是兒童感染EBV后，過(guò)度激活免疫反應(yīng)。患兒感染 EBV 后會(huì)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生強(qiáng)烈的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的T淋巴細(xì)胞[17]。所以病例組患兒CD3＋、CD8＋數(shù)量明顯高于對(duì)照組。專(zhuān)家認(rèn)為患兒CD3＋、CD8＋數(shù)量明顯升高應(yīng)注意嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生及患兒重癥IM發(fā)生的可能[18]。也有專(zhuān)家認(rèn)為，CD8＋T 細(xì)胞升高可以殺滅被感染的B細(xì)胞，消滅大部分EBV，疾病得以控制，因而臨床出現(xiàn)自限性過(guò)程[19]。CD4＋細(xì)胞不僅可以協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，中和抗原，還能誘導(dǎo)CD8＋T 細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用。IM急性期時(shí)，患兒體內(nèi)EBV特異性CD4＋細(xì)胞占血液循環(huán)1%左右，EBV特異性CD4＋產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而影響EBV陽(yáng)性B細(xì)胞增殖。與潛伏期比較，CD8＋T 細(xì)胞升高，通過(guò)分泌穿孔素直接殺傷感染EB病毒的B淋巴細(xì)胞。當(dāng)患兒進(jìn)入恢復(fù)期后，CD4＋細(xì)胞升高，CD8＋細(xì)胞 降低，表明機(jī)體免疫功能逐漸恢復(fù)正常，有效避免細(xì)胞因子大量分泌導(dǎo)致的過(guò)度免疫損傷[20]。

EBV進(jìn)入口腔及咽部后，B淋巴細(xì)胞最先受到感染，使細(xì)胞表面抗原遭到破壞、變性后，病毒在B細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，繼而累及全身淋巴組織及含淋巴細(xì)胞的組織，誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化、增殖，同時(shí)兩種CD8＋T細(xì)胞的平衡狀態(tài)被打破，大部分CD8＋T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成細(xì)胞毒性T細(xì)胞，導(dǎo)致強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，引起機(jī)體免疫應(yīng)答功能紊亂。同時(shí)在EBV感染的B淋巴細(xì)胞被溶解的過(guò)程中會(huì)分泌大量的炎性細(xì)胞因子，從而產(chǎn)生包括發(fā)熱、咽痛、淋巴結(jié)腫大等一系列臨床表現(xiàn)。而免疫低下者，缺乏這種免疫機(jī)制，導(dǎo)致病情難以控制，轉(zhuǎn)變?yōu)槁訣BV感染，成年后甚至發(fā)展為鼻咽癌等[21]。

EBV-DNA的定量檢測(cè)是診斷IM和監(jiān)測(cè)EB病毒載量的一種有效方法尤其適用于出現(xiàn)相關(guān)癥狀但EBV血清學(xué)抗體陰性的患兒，并可排除其它病原導(dǎo)致的傳染性單核細(xì)胞增多癥。可以反映出體內(nèi)EBVDNA感染和復(fù)制水平[22]。其敏感性達(dá)77%，特異性達(dá)99%。但是其檢測(cè)技術(shù)復(fù)雜，價(jià)格較高，有很多基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)不具備檢測(cè)條件，所以需結(jié)合其他檢測(cè)方法。如果EBV-DNA為低載量，而無(wú)臨床癥狀、體征，提示帶病毒狀態(tài)，不需要干預(yù)，但需定期隨訪。EBV的載量和病情的嚴(yán)重程度成正相關(guān)，臨床可以根據(jù)EBVDNA定量來(lái)判斷病情嚴(yán)重程度[23]。有研究觀察到經(jīng)治療后EBV-DNA陰性的患兒，免疫功能也恢復(fù)正常。

人體感染EBV后可以產(chǎn)生抗-衣殼抗體（VCA）、早期抗體（抗EA）、EBV核抗體（扛EBNA）。其中各種抗體中，早期出現(xiàn)VCA-IgM，為近期急性感染的主要標(biāo)志物；VCA-IgG一般提示既往感染；EA是病毒增殖的標(biāo)志，抗-EA一般提示原發(fā)感染恢復(fù)期，也提示近期感染。抗EBNA出現(xiàn)較晚，一般于感染后數(shù)周。VCAIgM最具有診斷價(jià)值，一般提示急性感染期，有較高的特異性，在診斷不典型IM具有極其重要的意義[24]。

有研究發(fā)現(xiàn)CD3＋、CD8＋細(xì)胞數(shù)量增加與重癥IM成正相關(guān)，與患兒病程和嚴(yán)重并發(fā)癥有關(guān)[18]。免疫狀態(tài)變化是患兒從感染發(fā)展到IM，慢性活動(dòng)性EBV感染，并發(fā)間質(zhì)性肺炎、心肌炎、血小板減少癥、溶血性貧血等等。有專(zhuān)家建議對(duì)IM患兒進(jìn)行定期隨訪，EB病毒與成年后的鼻咽癌、淋巴瘤有一定相關(guān)[25-26]。因此，檢測(cè)免疫功能并做好EB病毒相關(guān)腫瘤的早期監(jiān)測(cè)非常必要。

綜上所述，EBV 感染致IM患兒CD3＋、CD8＋細(xì)胞數(shù)量增加，結(jié)合EBV-DNA的定量檢測(cè)和抗體檢測(cè)，有助于IM的準(zhǔn)確診斷，并為治療方向的判定提供參考，為IM的免疫治療提供依據(jù)。