鹽脅迫條件下‘巴麻火麻’內生真菌的分離鑒定與多樣性分析

李娥 黃勇 孟園園 李璇 杜光輝 劉飛虎，

（1. 云南大學生命科學學院，昆明 650091；2. 云南大學農學院，昆明 650091）

土壤鹽漬化問題已經嚴重影響了農業和環境的發展。早在1997年，Shannon［1］就預測世界上1/3的耕地資源受到鹽害的影響［2］。目前，受鹽害的土地面積正在逐年增加。植物內生真菌是指在其生活史的一定階段或全部階段，生活于活體植物組織內且不引起明顯病害癥狀的一類真菌［3］。近來研究表明，一些內生真菌可以通過穩定植物營養元素吸收和保持離子平衡［4-6］，提高植物滲透調節能力［7］，保持植物光合作用和水分利用效率［8-10］，增強植物抗氧化防御系統［11-12］，產生次生代謝物或誘導相關耐鹽基因表達［13-14］等方面來保護宿主植物，減輕鹽害。

大麻（Cannabis sativa L.）為大麻科大麻屬的一年生草本植物，雌雄異株［15-16］。工業大麻是大麻的品種類型，其 THC 含量＜0.3%，在紡織、醫藥等多個領域都有運用，其產業前景樂觀［17-19］。工業大麻因其生長量大、適應性廣、抗逆性強，而成為鹽堿地大面積種植的重要經濟作物［20-21］。項目組前期研究發現，工業大麻品種‘巴麻火麻’苗期對NaCl脅迫的耐性較強［22］，但關于其內生真菌，特別是與大麻共生提高其耐鹽性的內生真菌的研究有待加強。為此，本研究以前期篩選的耐鹽工業大麻品種‘巴麻火麻’為研究材料，分別通過0、100、200、300 mmol/L NaCl鹽處理，探究大麻不同鹽濃度的內生真菌的變化情況，結合優勢度等參數篩選疑似大麻耐鹽內生真菌，期望為挖掘與大麻共生提高大麻耐鹽性的內生真菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試工業大麻品種‘巴麻火麻’由廣西壯族自治區農業科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 大麻鹽脅迫處理及樣品采集 試驗采用盆栽法，塑料盆底直徑16 cm、高19 cm（帶托盆），裝入泥炭基質（挪威JIFFY公司生產）1 kg，每盆施復合肥（NPK比例為13∶11∶11）10 g。一次性澆透水，每天保持適宜的土壤濕度，每隔1周移動塑料盆的位置，保證大麻光照均勻。出苗1周后間苗，每盆留下長勢相同的5株大麻，待4對真葉時，每盆追肥300 mL（300 g復合肥+20 g尿素溶于10 L水中）。追肥一周后，盆栽大麻分為4組，每組4盆，分別澆濃度為100 mmol/L、200 mmol/L和300 mmol/L的NaCl溶液及清水（對照），每隔4 d澆一次，每次每盆澆溶液（或清水）300 mL；持續5次后停止澆灌。NaCl處理結束7 d后，從每個處理中隨機挑選4株長勢一致的大麻植株，分別采集根、莖、葉。其中，從上往下數第3、6、9對真葉分別標記為上葉（sy）、中葉（zy）和下葉（xy）；莖從上往下15 cm、15-45 cm、45-60 cm 分為上莖（sj）、中莖（zj）和下莖（xj）。各處理、各部位樣品分別放入滅菌的牛皮紙中。標記，封口，4℃低溫保存。

1.2.2 內生真菌的分離和純化 用自來水將大麻各組織樣本沖洗30 min，去除表面的泥土及附屬物。用濾紙吸干表面水分，用剪刀或者解剖刀截取2-3 cm的小段，置于滅菌燒杯中，放入超凈工作臺。經75%乙醇漂洗30 s，無菌水沖洗3-4次，再用NaClO（有效氯含量為3%）漂洗5 min，最后無菌水沖洗3-5次。將消毒后的組織材料用無菌刀片剪成若干0.5 cm×0.5 cm小塊，各處理小塊分別置于含有硫酸鏈霉素和氨芐青霉素的PDA平板上，處理組各取5株大麻，每株的7個部位各取10片組織片，每個處理共有70個組織片，5個重復。取最后一次洗液200 μL涂布于PDA培養基作為對照組，將組織片按壓在PDA培養基上按壓3次，在整個操作過程中打開3個培養皿，將3種檢驗方法的培養皿在相同條件下培養［23］。于（25±2）℃恒溫箱中暗培養。接種組織塊后第8天，統計內生真菌數量。

1.2.3 內生真菌鑒定 對分離得到的真菌進行ITS序列進行比對分析。DNA提取采用尿素法，分別以真菌通用引物 ITS5（5′-3′：GGAAGTAAAAGTCGTAACAACG）和 ITS4（5′-3′：TCCTCCGCTTATTGATATGC）（碩擎生物公司合成）為上下游引物進行擴增。PCR擴增反應體系如下：DNA模板2.5 μL，ITS4 1 μL，ITS5 1 μL，2×Taq mix 12.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴增程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35個循環，72℃延伸 8 min，4℃ 保存。PCR 擴增產物于l.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測出目的條帶的PCR擴增產物送至上海生物工程公司測序，測序結果用CExpress軟件等進行序列校對，再通過ClustalX（1.8）和Phylip等軟件進行OTU分析，相同序列選其中一條作代表序列，登錄NCBI進行Blast比對（相似性97%以上為同種）。

1.2.4 數據分析 利用Excel 2016進行數據的統計。采用分離率（該指標可以衡量在一個特定的植物組織樣品中內生真菌的豐度以及植物組織樣品中多重侵染的頻率）、Berger-parker優勢度（表示一個種屬在群落中的地位與作用）、Sorenson相似性指數（反映內生真菌群落的相似性系數）、Shannon-Wiener多樣性指數指數（反映種群豐富度和均勻度）等指標反映不同濃度鹽脅迫下大麻內生真菌的分離情況。各參數計算公式如下：

式中：k為某樣品中內生真菌種數；pi是指某樣品中某種（屬）內生真菌i數量占全部內生真菌菌株總數的百分比。

式中：K指兩種樣品中共有的內生真菌種類數，a指其中一種樣品的內生真菌種類數，b指另一種樣品的內生真菌種類數 。

式中：H為多樣性指數，S為菌種類型總數。

式中：S是菌種類型總數，N是菌株總數。

2 結果

2.1 不同鹽濃度下大麻內生真菌種類

采用涂布檢驗、組織壓片法檢驗、超凈工作臺檢驗3種方法的PDA培養基均無菌落長出，說明表面消毒徹底，分離的真菌屬于內生真菌（圖1）。本研究4個處理7個部位的1 400個大麻組織中共分離得到內生真菌543株，合并后得到88株菌，隸屬于14個科18個屬44個種。其中，對照組上葉、中葉、下葉、上莖、中莖、下莖和根7個部位中分別分離到9、14、41、7、11、21和50株真菌；100 mmol/L NaCl處理下分別分離到4、19、44、4、6、18和21株真菌；200 mmol/L NaCl處理下分別分離到4、15、32、5、16、8和44株菌；300 mmol/L NaCl處理下分別分離到14、12、25、10、5、34和50株菌。各處理分離得到內生真菌種屬見表1。根據不同處理下分離得到內生真菌屬繪制相對豐度，0 mmol/L NaCl處理下‘巴麻火麻’內生真菌主要包括以下類群 ：Alternaria、Annulohypoxylon、Aphanocladium、Chaetomium、Cladosporium、Colletotrichum、Diaporth、Nemania、Neocosmospora、Nigrospora、Hypoxylon和Trichoderma，其中Trichoderma、Cladosporium和Chaetomium為優勢屬；100 mmol/L NaCl處理下‘巴麻火麻’內生真菌主要包括以下類群：Alternaria、Annulohypoxylon、Aphanocladium、Chaetomium、Cladosporium、Fusarium、Hansfordia、Kretzschmaria、Nemania、Neocosmospora、Nigrospora和 Trichoderma，其中Trichoderma、Nigrospora、Cladosporium為優勢屬；200 mmol/L NaCl處理下‘巴麻火麻’內生真菌主要包括以下類群：Annulohypoxylon、Chaetomium、Cladosporium、Diaporth、Fusarium、Hansfordia、Trichoderma，其中Trichoderma Cladosporium和Fusarium為優勢屬；300 mmol/L NaCl處理下‘巴麻火麻’內生真菌主要包括以下類群：Alternaria、Annulohypoxylon、Chaetomium、Cladosporium、Diaporth、Fusarium、Nigrospora、Pleosporales、Hypoxylon和Trichoderma，其中Trichoderma、Cladosporium和Fusarium為優勢屬、枝孢霉和哈茨木霉在各處理組中占比都大（圖2）。

圖1 內生真菌滅菌效果檢測圖Fig. 1 Sterilization effect of endophytic fungi

圖2 不同鹽處理下內生真菌的相對豐度Fig. 2 Relative abundance of endophytic fungi under different salt treatments

Alternaria sp..，m m，m③ladosporium sp②kahawae，ospora（22）albu e，igrospora usariu entosa，ocladium ania rospora dosporium eocosm -2018，ig Hypoxylon ph Hypoxylon fragiform dium arzianum，ium globosu maria pavim ia diffusa，N，N an Fusarium ypoxylon Colletotrichum la atroroseum，em usarium sp.，globosum，Cladosporium dosporium sp.，F s of salt stress ia diffusa②，richoderma Nemania diffusa，Leptosphaeria phanocla ypoxylon stygium，N a h ，H SP troroseum，ypoxylon stygium，A m oxysporum②，iseti②haan e novem，N Kretzsch crospora，C-2018，arzianum②，ma 20）lobosum②la sp.，m equ Annulohypoxylon stygium，F an Chaetomium leospora m oxysporum（11）m sp.，T globosum②，usariu Diaporth erma h les sp. 9 M Nigrospora sphaerica，A etomoxysporum②eris（20）em nulohypoxylon bovei，C Trichoderm Alternaria nn SP Nigrospora sphaerica，N，Cem arzianum，C uloh aria sp.，F usariu richod Diaporthe novem，N m sp.，P Annulohypoxylon a haetom m g olletotrichu aetomium tion rzianum，rium nnulohypoxylon s cucum Nigrospora oryzae，Species iu usariu Hypoxylon trugodes（centra An nn m，ovem②，uloh Pleosporales sp. 9 M X40，ia sp. JP38-6，oryzae，AHa nulohypoxylon stygium，A microscopica，A erianu nsfordia a h usariu fragiforme，CCh aria sp，R60.1，equ iseti，Fsa Altern Fu sp.，an solani，C m，種An albu Fusarium Neocosmospora rubicola，sp.，bicola，T nia sp. ANema diffusa，Hansford Trichoderm equiseti，F Diaporthe n oryzae，F Altern atephoru ru pilgha Th較，，，igrospora 黑m 枝 孢 孢 團 霉霉孢m毛 墊 霉 （8）殼菌菌 霉孢霉孢屬，菌菌菌菌 屬孢孢屬ifferent con孢屬屬，種er d比類孢，lternaria鏈m鐮 孢霉離nd usariu lternaria鏈iu m鐮ypoxylon炭斯les格菌ladosporiu霉ladosporiu m鐮菌p” u格ansfordia漢分igrospora 黑m 枝 孢 疽 屬 菌em 點格oderma木屬ladosporiu usariu leospora真em ，N ，C ，F菌菌屬，C ，H olletotrichum炭孢團腔，A haetomania炭，N，N usariu igrospora 黑m 枝，A rich ，F屬，H屬屬，H生a h，C olletotrichum炭 菌 腔 （14），C屬屬，C iaporth莖屬，N，F，C霉病屬eptosphaeria小菌霉霉屬 屬屬屬屬屬屬，P菌菌 菌菌內am ypoxylon炭球richoderma木屬屬屬枝菌屬霉，T（13）霉菌菌菌孢菌孢屬團殼ber of each species，D團殼格iaporth莖孢屬麻”dium絲oderma木墩um ium毛ium毛鏈疽菌團殼etomania炭霉a木，D ia nulohypoxylon炭 團ha dosporium 枝菌屬Hypoxylon炭porth莖疽屬點腔，L etomania炭ted from “B maria炭Genera ospora炭霉屬墊em火em eocosm nulohypoxylon炭nulohypoxylon炭團墊枝點病，T ha巴，N孢霉，N ia漢rich etom phanocla麻ium毛la lternaria usariu ha，N，C，D，A leosporales格菌屬，T目” refer to the n屬，A 數下“la 屬An屬，C，F nulohypoxylon炭An，C屬病，P的迫，C屬Kretzsch病Neocosmospora炭菌Aphanocladium絲m鐮斯屬霉屬屬屬屬霉An 屬 屬Hansford An 屬 霉 疽 屬Trichoderm（13）個種and ③脅度tic fun gi iso，，，） 各，②鹽科科 ，科到，科離菌科is（6）殼菌ocreales incertae科蓋菌濃hy菌菌分蓋，孢，孢示同op 竹 ，孢 竹科枝殼科科枝表從竹科枝1 不 殼f end從殼ypocreales赤蓋ectriaceae ocreaceae殼iaporthaceae，菌ladosporiaceae，H③”，赤iaceae 毛 殼n of species o yp yp ，D eratobasidiaceae（9 ladosporiaceae②、ocreaceae表科，C球，H藻haetom iaceae 毛，H ，H，H iaceae 毛ectriaceae iaceae 毛ladosporiaceae藻 ，C，N科ypocreaceae era and species，and “①①、毛，“，C球 科，C科haetom，C科球赤殼藻殼haetom ylariales incertae sed haetom毛科菌，C科科目gi，gen赤數，C菌科科，C科菌毛總菌pariso 從Trichosphaeriaceae從 孢菌科枝蓋 科孢aeriaceae殼腔從小科孢Nectriaceae的小赤球科，X科孢菌iaporthaceae，Nyp角多 角多 角多 種ber of fun Families 炭Xylariaceae炭richosphaeriaceae erellaceae，um richosph Xylariaceae屬科incertae sedis，D小炭炭，ble 1 C om osporiaceae竹Glom，T Pleosporaceae科Glom，T sedis，科（9）Xylariaceae Pleosporaceae Xylariales incertae sedis（9）角Clad Hypocreaceae Xylariaceae Pleosporaceae erellaceae菌科Leptosphaeriaceae真到Ta Salt concentration離refer to the total n示分）”數bers in “（表字里面um度濃mm ol·L-1）（）”he n注Note：“：T鹽/（0000102030

將4個處理始終存在的內生真菌通過NCBI序列比對，相似性97%以上為同種，4個處理始終存在的內生真菌的具體信息見表2，不同鹽處理始終存在的內生真菌有球毛殼菌（Chaetomium globosum）、炭墊菌（Nemania diffusa）和炭團菌（Annulohypoxylon stygium）主要存在于大麻中葉和下葉中，而哈茨木霉（Trichoderma harzianum）主要在大麻根中存在，枝孢霉（Cladosporium）在各組織部位均存在（表3）。

表2 不同濃度鹽脅迫下“巴麻火麻”始終存在的內生真菌及其ITS序列分析Table 2 Endophytic fungi and its sequence analysis of ‘Bama hemp’ under different concentrations of salt stress

表3 不同濃度鹽脅迫下“巴麻火麻”始終存在的內生真菌分離數目Table 3 Number of endophytic fungi isolated from ‘Bama hemp’ under different concentrations of salt stress

2.2 內生真菌多樣性分析

在0-300 mmol/L NaCl處理下，大麻內生真菌的豐富度指數在1.11-2.31之間，呈現先降后升趨勢，200 mmol/L NaCl處理下內生真菌的豐富度指數最低，且與其他處理差異顯著（圖3-A）；均勻度指數卻呈現先升高后降低的趨勢，300 mmol/L NaCl處理下最低，且與其他處理差異顯著（圖3-B）；在0-300 mmol/L NaCl處理下，內生真菌的分離率在23%-42.85%之間，呈現先降后升趨勢，100 mmol/L NaCl處理下最低，且與其他組差異顯著（圖3-C）；在0-300 mmol/L NaCl處理下，多樣指數在1.30-1.78之間，呈現先降后升趨勢，200 mmol/L NaCl處理下與其他3組差異顯著（圖3-D）。不同鹽濃度間大麻內生真菌相似性比較發現，相似性系數差異不顯著，但均小于0.5，說明鹽處理影響了真菌群落組成（表4）。

表4 不同鹽濃度間大麻內生真菌相似性系數比較Table 4 Comparison of similarity coefficient of hemp endophytic fungi among different salt concentrations

圖3 不同濃度鹽處理下大麻內生真菌的多樣性分析Fig. 3 Diversity analysis of endophytic fungi in hemp under different concentrations of salt treatment

3 討論

‘巴麻火麻’為廣西省當地的籽用工業大麻品種。項目組的前期研究發現，其耐鹽堿能力較強［20］。除了自身組織結構、生理特性以及分子機制外，大麻內生真菌是否能夠增強其耐鹽性，值得深入分析。本研究的結果初步發現：各處理相似性系數均小于0.5，說明鹽處理影響了內生真菌的群落組成。隨著鹽濃度增加內生真菌多樣性指數、豐富度、分離率先降后增，100 mmol/L NaCl處理下內生真菌分離率最低，200 mmol/L NaCl處理的內生真菌豐富度、多樣性指數最低，說明一定的鹽濃度會導致一些耐鹽內生真菌數量和種類減少，一些對鹽敏感的內生真菌死亡，使一類或者幾類耐鹽內生真菌占優勢地位。

以往的研究，只是基于常規栽培環境下的內生真菌的分離、鑒定和分析［24-25］。但是缺乏在鹽脅迫下大麻內生真菌的研究。本研究設置了不同濃度的NaCl處理，希望通過鹽濃度的變化，發現大麻內生真菌的變化情況，尋找到與大麻共生提高大麻耐鹽性的內生真菌。研究發現，各鹽處理組內生真菌種類不同，但有3個科始終存在（炭角科、毛殼科和枝孢菌科），5個屬始終存在（炭團菌屬、毛殼菌屬、枝孢霉屬、炭墊菌屬和木霉菌屬），5個種始終存在（毛殼菌、哈茨木霉、炭墊菌、枝孢霉和炭團菌）。雖然，本研究分離到的毛殼菌、鐮孢菌、鏈格孢、小球腔菌、格孢腔菌、枝孢菌、球護殼菌、炭團菌和炭墊菌等是常見的植物內生真菌［26-27］，但不同鹽處理下枝孢菌、球毛殼菌、炭團菌、炭墊菌和哈茨木霉始終存在，這5種內生真菌不隨鹽濃度增加而消失，推測這幾種菌可能與提高植物耐鹽性有關。

有報道稱，枝孢菌、球毛殼菌為耐鹽內生真菌［26］，球毛殼菌能拮抗多種病原菌［28］，還能產生赤霉素和吲哚乙酸和提高干旱條件下辣椒生長［29］，但關于球毛殼菌、枝孢霉、炭團菌協助植物抵御鹽脅迫的研究未見報道。哈茨木霉則已經報道能在鹽脅迫下提高水稻、玉米、小麥［30］、芥菜［31］等多種植物耐鹽性［32］。炭墊菌是重要的生防菌，但炭墊菌的耐鹽性或協助植物抵御鹽脅迫的研究還未見報道。

目前，關于植物內生真菌協助植物抵御鹽脅迫機制涉及穩定植物營養元素吸收［33］、提高植物滲透調節能力［34］，保持植物光合作用和水分子利用率［10］、提高植物抗氧化能力［35］、分泌植物促生長相關激素［36］、拮抗鹽脅迫中的致病菌［37］及誘導相關耐鹽基因表達［38］等，但沒有統一定論。本研究發現，‘巴麻火麻’在0-200 mmol/L NaCl處理下，其內生球毛殼菌和哈茨木霉的數量會隨致病菌的增加而增多。而報道稱球毛殼菌和哈茨木霉可以抑制相關致病菌[38]，故推測鹽脅迫導致致病菌入侵植物根部機率增加，從而導致拮抗致病菌的植物內生真菌增殖。

4 結論

在不同鹽濃度處理下，分析‘巴麻火麻’7個部位1 400個組織片中內生真菌變化情況發現：5種內真菌枝孢菌、球毛殼菌、炭墊菌、炭團菌、哈茨木霉在不同處理下始終存在，且變化有一定規律。推測幾種內生真菌與大麻耐鹽性有關。