RNAi與轉Bt基因技術協同抗蟲研究進展

鄧普榮 劉勇波

（中國環境科學研究院 環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012）

噴施化學農藥降低了害蟲對經濟作物的危害，但同時也帶來了環境污染問題［1］。轉基因抗蟲作物的商業化種植降低了化學農藥的使用［2］?，F今，轉Bt基因棉花（Gossypium hirsutum）、油菜（Brassica napus）和玉米（Zea mays）等已在美國、加拿大等國家廣泛種植［3］。我國也從1997年開始廣泛種植了抗蟲轉Bt基因棉花［3］。隨著轉Bt基因植物在田間大面積的連續種植，使得靶標害蟲對Bt毒素產生抗性進化，影響了轉Bt基因植物的抗蟲效果［4］。因此，為延緩靶標害蟲的抗性進化，在轉基因植物周邊種植非轉基因植物來建立“庇護所”，或者構建多個基因的轉基因抗蟲植物［4-5］。此外，也有研究將RNAi技術與轉Bt基因抗蟲技術相結合，在大田噴施雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）殺蟲劑或者構建雙價轉dsRNA+Bt基因植物，延緩靶標害蟲的抗性進化，同時協同提高作物的抗蟲能力［6-7］。因此，本文將首先介紹RNAi干擾機制及其在農業害蟲防控方面的應用，然后綜述了RNAi干擾技術協同轉基因抗蟲技術的研究進展。

1 RNAi干擾機制

1998年，Fire等［8］首 次 在 秀 麗 隱 桿 線 蟲（Caenorhabditis elegans）發現dsRNA是引發轉錄后基因沉默的主要原因，并將這種現象定義為RNAi。RNAi即當外源dsRNA進入宿主細胞后，細胞內的核酸內切酶Dicer識別并加工dsRNA為21-25 bp的siRNA（small interference RNA，siRNA），siRNA會與細胞內特異性的酶結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC與宿主細胞中特定基因的mRNA結合，引發目標基因mRNA的轉錄后基因沉默［9-10］。在昆蟲中，dsRNA介導昆蟲基因沉默還需要dsRNA攝取和系統擴散的蛋白參與［11］。昆蟲主要通過兩種方式吸收和傳遞dsRNA，第一種是跨膜蛋白SID-1蛋白（系統RNAi缺陷性蛋白）介導的dsRNA的細胞間轉運［12］；第二種是通過受體介導的細胞內吞作用傳遞 dsRNA［13-14］。

2 RNAi技術應用于農業害蟲防控

RNAi技術不僅用于昆蟲尤其是非模式昆蟲的生殖生長、發育調控、免疫調節和環境應答等過程中關鍵基因的功能分析，也廣泛用于害蟲防治的應用研究中。昆蟲生長發育中的一些功能基因的干擾常引發昆蟲的生長發育的異常，甚至死亡，例如昆蟲的幾丁質酶基因［15］、v-ATPase基因［16］、蛹期特異性基因［17］、電子傳遞鏈蛋白［18-19］和昆蟲激素相關基因［6］。這些基因常作為RNAi害蟲防治的重要靶標。RNAi已用于多種農業害蟲的防治，例如鱗翅目［15］、半翅目［20］、雙翅目［21］、鞘翅目［16］、膜翅目和蜚蠊目［22］等昆蟲，以及線蟲［23］、蜱、螨［24］等的防控研究。使用方法主要有兩種：田間直接噴施dsRNA殺蟲劑和植物介導的RNAi抗蟲技術。

2.1 噴施dsRNA殺蟲劑

將dsRNA作為生物農藥直接噴施或灌溉常應用于大田害蟲的綜合治理［25-26］。例如將靶向亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）幼蟲發育相關基因的dsRNA溶液噴灑給幼蟲，噴灑的dsRNA能夠穿透亞洲玉米螟幼蟲的體壁，并在昆蟲體腔內循環，致使玉米螟幼蟲發育遲緩［26］。San等［27］在馬鈴薯（Solanum tuberosum）葉片上噴施靶向馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）Actin基因的dsRNA，顯著提高了馬鈴薯甲蟲的死亡率。除了將dsRNA直接噴灑給昆蟲幼蟲和植物葉片引發死亡，dsRNA也可被植物根系吸收，再由植物維管系統運輸到各個組織中，引發攝食植物的昆蟲死亡［28］。用熒光標記的dsEYFP溶液浸泡水稻（Oryza sativa）根系24 h后，水稻鞘和莖部以及取食水稻的稻飛虱（Nilaparvata lugens）體內均可檢測到dsEYFP［28］。用dsActin溶液灌溉水稻或玉米能干擾昆蟲Actin基因表達，顯著提高了取食水稻或玉米的稻飛虱和亞洲玉米螟的死亡率［28］。

然而，大田噴施的dsRNA能快速降解，制約了dsRNA的抗蟲效率。Dubelman等［29］在土壤中施用dsDvSnf7后發現，dsRNA會在施用后約2 d內降解，并無法檢測到生物活性，dsRNA并未在土壤環境中持續存在或積累。Fischer等［30］對釋放到水環境中的dsDvSnf7殘留時間分析，表明dsRNA在淡水環境中也能迅速降解。

為了提高在大田噴施dsRNA的抗蟲效率，采用微生物傳遞、脂質體修飾和納米材料包埋等釋放dsRNA的新方法［31］。利用微生物傳遞dsRNA時，常將基因工程改造后穩定表達dsRNA的微生物施用給昆蟲［32］。將干擾東方黏蟲（Mythimna separata）幾丁質酶基因（Chitinase，MseChi）的dsRNA 轉入大腸桿菌中表達，施用該大腸桿菌能有效防控東方粘蟲［15］。利用脂質體包埋也可高效傳遞dsRNA，如Huang等［33］用脂質體載體包埋的微管蛋白dsRNA能有效防控德國小蠊（Blattella germanica）。此外，DNA納米結構也成為dsRNA高效傳遞的載體［34］。

2.2 轉dsRNA植物介導的害蟲防治

轉dsRNA植物介導的害蟲防治指利用轉基因技術在植物中表達的特異性dsRNA，并通過昆蟲攝食植物引發昆蟲相關基因的轉錄后基因沉默即宿主誘導的基因沉默（host inducing gene silence，HIGS），干擾害蟲新陳代謝和生長發育的關鍵基因［35］。擬南 芥（Arabidopsis thaliana）［36］、 煙 草（Nicotiana tobacum）［37］、馬鈴薯［38］、玉米［39］、小麥（Triticum aestivum）［40］、棉花［19］和大豆（Glycine max）［39］等多種作物均培育了轉dsRNA基因抗蟲品種。

Mao等［41］最先通過構建轉dsRNA基因的擬南芥和煙草植株，干擾棉鈴蟲P450單加氧酶基因：CYP6AE14基因的表達，削弱棉鈴蟲對棉酚的耐受性，調控棉鈴蟲幼蟲的生長發育。從290個候選基因中鑒定出干擾基因v-ATPase表達最具調控玉米根葉甲（Diabrotica virgifera virgifera）幼蟲生長的潛力，Baum等［42］將dsv-ATPase A基因轉入玉米中，能有效防控玉米根葉甲。

植物介導的RNAi已成功應用于半翅目蚜科害蟲的防治［10，43］。例如在擬南芥中表達靶向桃蚜（Myzus persicae）絲氨酸蛋白酶基因（serine protease，MySP）的dsRNA，顯著降低了桃蚜MySP基因的表達量［44］。將玉米根葉甲v-ATPase C基因的dsRNA轉入玉米中，Li等［45］發現與短鏈RNA相比，長鏈dsRNA能高干擾玉米根葉甲v-ATPase C基因表達。將靶向棉鈴蟲幾丁質酶基因（HaCHI）的dsRNA轉入煙草和番茄（Lycopersicon esculentum）中，致使棉鈴蟲幼蟲發育畸形［46］。以番茄潛葉蛾（Tuta absoluta）v-ATPase A和精氨酸激酶（Arginine kinase，AK）基因為干擾靶點，將針對v-ATPase A和AK的dsRNA轉入番茄葉片中，番茄潛葉蛾幼蟲死亡率增加，減少了昆蟲取食對番茄葉片的損傷［47］。將針對根結線蟲（Meloidogyne incognita）的16D10轉入葡萄（Vitis vinifera）根系，抑制了根結線蟲對葡萄根系的侵染［23］。

轉dsRNA植物介導的RNAi技術優化了dsRNA的傳遞方式，但dsRNA易被植物細胞質中的Dicer酶降解為小片段，影響長鏈dsRNA的完整性［48］。而且昆蟲腸道中的RNase也會降解昆蟲攝食的dsRNA，降低dsRNA的干擾效率，影響殺蟲效果［49］。Bally等［50-52］提出將dsRNA在植物細胞器—葉綠體中表達的方法，保護了轉基因植物中dsRNA的完整性，提高了dsRNA從植物到昆蟲的傳遞效率。

3 靶標害蟲對轉Bt基因植物的抗性進化

隨著轉Bt基因植物的連續種植，靶標害蟲對轉Bt基因植物進化產生抗性［4，53］。靶標害蟲對Bt蛋白產生抗性進化的分子機制是：靶標害蟲中腸環境中蛋白酶［54-55］的改變和中腸刷狀緣膜囊上Bt蛋白特異性受體蛋白如類鈣黏蛋白［56］、堿性磷酸酶、氨肽酶N［57］與ABC轉運蛋白［58］等多種蛋白的突變常引起Bt蛋白抗性［59-60］。為減緩靶標害蟲對轉Bt基因作物產生抗性進化，主要有以下幾種方法：（1）通過串聯疊加多種抗蟲基因，擴大轉基因植物的殺蟲譜，例如轉Bt和豇豆胰蛋白酶抑制劑（Cowpea trypsin inhibitor，CPT1）基因（Cry1Ac+CPT1）水稻［61］、轉Cry1Ah+Cry1Ie基因玉米［62］和轉融合Bt與蘇云金芽胞桿菌營養期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal protein，Vip）基因（Cry1Ab+Vip3A）水稻［63］。然而，由于多種抗蟲蛋白存在交互抗性現象，這種串聯疊加多種抗蟲基因減緩靶標害蟲抗性進化還有待深入研究［64］；（2）高劑量表達Bt蛋白提高轉基因作物對靶標害蟲的毒性，使得抗性等位基因不能遺傳給下一代［65-66］，如果抗性表現為隱性遺傳，高劑量表達能有效延緩靶標害蟲的抗性進化。然而，高劑量策略對其他抗性類型的昆蟲帶來高選擇壓力，加速其抗性進化；（3）此外，構建非轉基因植物“庇護所”的方法能有效延緩害蟲抗性進化［4］。

4 RNAi與轉Bt基因技術協同抗蟲

將RNAi和轉Bt基因抗蟲技術結合研發雙價轉基因抗蟲作物，增加昆蟲對Bt蛋白的敏感性以提高殺蟲效率，成為延緩靶標害蟲對Bt蛋白產生抗性進化的有效途徑之一。例如，孟山都公司研究發現轉dsDvSnf7玉米對抗玉米根葉甲的抑制作用［67］，并培育出轉dsDvSnf7和Cry3Bb1基因的抗蟲轉基因玉米的新品種MON87411并在市場中推廣種植［7，68］。

首先，RNAi和Bt蛋白能否聯合協同抗蟲需要找到昆蟲生長發育和新陳代謝中的關鍵基因。胰凝乳蛋白酶（chymotrypsins，CTP）作為鱗翅目昆蟲的一種主要的蛋白水解消化酶類，在昆蟲體內降解活化的Bt毒素、降低Bt毒性、誘導抗蟲性方面發揮重要作用。通過 RNAi干擾亞洲玉米螟幼蟲中的7個CTP基因，顯著提高了Cry1Ab蛋白對亞洲玉米螟幼蟲的死亡率［69］。有研究表明，抑制甜菜夜蛾幾丁質合酶B基因（Chitin synthase B，CHS-B）的表達，可顯著增加其幼蟲的死亡率，飼喂dsCHS-B也提高了Cry1Ac和Cry1Ca蛋白對甜菜夜蛾幼蟲的毒性［70］。影響昆蟲激素代謝的關鍵酶類也成為RNAi與轉Bt基因協同抗蟲的作用靶標。通過RNAi抑制昆蟲保幼激素（juvenile hormone，JH）代謝中的保幼激素酸甲基轉移酶（JH acid methyltransferase，JHAMT）和保幼激素結合蛋白（JH-binding protein，JHBP）基因，培育轉Bt基因和dsRNA的雙價轉基因抗蟲棉花顯著增加靶標害蟲致死率，延緩了靶標害蟲對Bt蛋白的抗性進化［6］。v-ATPase是質子泵在昆蟲中為新陳代謝供能，RNAi抑制棉鈴蟲中v-ATPase A基因的表達，提高了棉鈴蟲幼蟲對活化的Cry1Ac蛋白的敏感性［71］。因此，RNAi干擾昆蟲關鍵功能基因的表達，提高害蟲對Bt蛋白的敏感性，提升Bt毒素的殺蟲效果成為減緩昆蟲對Bt蛋白抗性的有效方法［6，69］。

其次，RNAi和轉Bt基因抗蟲技術能否協同抗蟲，需要研究RNAi干擾昆蟲的功能基因是否影響Bt毒蛋白對靶標害蟲的殺蟲效果。向甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲體內注射抑制抗菌肽gloverin—Seglv的dsRNA，提高了甜菜夜蛾對Bt蛋白的敏感性［72］。Ochoa-Campuzano等［73］在馬鈴薯甲蟲中也有類似發現，抑制馬鈴薯甲蟲幼蟲中與Bt蛋白互作的腸膜蛋白—prohibitin-1蛋白表達，幼蟲對Cry3Aa蛋白的敏感性增強，使得昆蟲在培養的第5天死亡率達到100%。由于Sl102基因在海灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）血細胞中高表達，參與細胞的免疫過程，通過大腸桿菌介導的RNAi抑制Sl102基因的表達后，增加了?；页嵋苟陮ry1Ca蛋白的敏感性［74-75］。通過小菜蛾（Plutella xylostella）Bt蛋白抗性種群和敏感種群進行中腸轉錄本的表達差異分析，發現3個基因：PxSDF2L1、PxCDKAL1和PxHEL-1在抗性品系中顯著上調表達，用RNAi抑制這3種基因的表達，對Bt蛋白抗性和敏感小菜蛾幼蟲的死亡率都增加，與敏感系相比抗性群體的死亡率上升更為顯著［60］。由此可見，由RNAi介導的抑制昆蟲功能基因可以協同Bt蛋白介導的轉基因技術用于害蟲防治（表1）。

表1 RNAi與轉Bt基因技術協同抗蟲Table 1 Synergistic application of RNAi and Bt-transgenic technologies in controlling pests

5 展望

RNAi干擾與轉Bt基因抗蟲技術結合不僅有望延緩靶標害蟲對Bt蛋白的抗性進化，同時RNAi抗蟲技術具有序列特異性和種屬特異性的優勢，可防治特定的害蟲種類（表2）。兩種生物抗蟲技術的結合有望成為一種綠色環保和可持續發展的害蟲綜合防控技術。

表2 RNAi技術應用于農業害蟲防控Table 2 RNAi technology applied in controlling agricultural pests

然而，RNAi干擾與轉Bt基因抗蟲技術協同抗蟲面臨一些挑戰。首先，RNAi技術在應用于抗蟲的過程中受到一些因素的制約：（1）RNAi的干擾效率受到昆蟲對dsRNA的傳遞吸收效率、劑量效應、目的基因組織特異性的影響，同時農業害蟲的生命周期和攝食行為也是干擾RNAi效率的重要因素［79-81］；（2）dsRNA不但引發靶基因的轉錄后基因沉默，還可能引發非靶標基因的轉錄后基因沉默而產生脫靶效應［82］；（3）針對靶標害蟲特異性的dsRNA可能影響非靶標害蟲的種群動態［83］。

其次，將RNAi技術與轉Bt基因抗蟲技術聯合用于大田面臨一些技術難題。例如昆蟲的一些重要功能基因是否都可用RNAi技術實現高效基因沉默？害蟲攝取的RNAi是否會被其序列多態性所規避［84］？由于害蟲對Bt蛋白存在著抗性進化，轉dsRNA和Bt基因的雙價轉基因抗蟲植物是否也會在田間連續種植栽培中對dsRNA產生抗性而降低其抗蟲效果［85］？在RNAi和轉Bt基因聯合作用時，dsRNA與Bt蛋白二者之間作用的獨立效應已得到證明，但兩種方式的獨立作用是否與RNAi選擇的靶基因存在交互影響還有待深入研究［7］。

此外，基于轉dsRNA和Bt基因雙價轉基因植物釋放的環境安全性和食品安全性的評估目前仍不充分，缺乏對雙價或多價轉基因植物的評估標準。