增殖誘導配體蛋白的核酸適配體篩選與特異性研究

鄭芳芳 林俊生

（1. 泉州醫學高等專科學校基礎醫學部，泉州 362011；2. 華僑大學醫學院，泉州 362021）

APRIL是1998年由Hahne等［1］首先發現并克隆成功的腫瘤壞死因子家族新成員，其過表達在多種腫瘤細胞的增殖、存活及腫瘤形成方面有獨特作用，體外研究顯示可溶性APRIL以劑量依賴方式促進多種腫瘤細胞增殖，且在血清濃度很低的條件下也可促進腫瘤細胞快速增殖［2］。因此，APRIL作為檢測腫瘤發生和抑制腫瘤增殖的靶點具有可行性，潘超等［3］的研究也證實了這一點。

2013年，GAO等［4］研制了人源化抗APRIL抗體，可有效抑制腫瘤細胞在體內外的增殖，且具有降低免疫應答的潛能。大量試驗研究也表明抗APRIL藥物在多種腫瘤治療方面具有極大的應用前景［5-6］。截至目前已有多項APRIL藥物進入臨床試驗階段。但APRIL藥物研發集中在抗體，抗體具有制備復雜、周期長、不易保存且價格昂貴等缺點，因此，探索一種低成本、制作簡便且易保存的APRIL藥物是十分必要的。

1990年，Szostak［7］和 Gold［8］兩 個 研 究 小組分別獨立地提出了指數富集配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）體外篩選技術，通過SELEX技術篩選出的寡核苷酸，我們稱之為核酸適配體（aptamer），可與多種類型的靶分子特異性結合，具有分子量小、制備簡便、成本低、穩定性高、低免疫原性、易于修飾等優勢［9］，目前廣泛用于藥物輸送、生物技術和生化檢測方面，尤其在腫瘤標志物、食品安全和環境污染物檢測上展現了很好的應用前景［10-12］。本研究旨在利用磁珠-SELEX技術篩選出APRIL蛋白核酸適配體，并鑒定其親和力和特異性，為后續開展APRIL蛋白生物檢測方法的研究和腫瘤藥物的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

80 nt隨機起始單鏈ssDNA文庫，兩端各為20 nt固定序列，中間為40 nt的隨機序列：5-AGCAGCACAGAGGTCAGATG（N40）CCTATGCGTGCTACCGTGAA、FAM-P1：5-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、Biotin-P1：5-biotin-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、P1：5-AGCAGCACAGAGGTCAGATG、P2：5-TTCACGGTAGCACGCATAGG、Spacer18-P2：5-poly（dA20）-Spacer18-TTCACGGTAGCACG，相關 DNA和文庫由上海生工合成。APRIL蛋白、BAFF蛋白購自南京金斯瑞公司，Dynabeads M-270 Carboxylic Aicd購 自Life Technologies Corporation公 司，Flash Hot Start MasterMix（Dye）購自康為公司，TritonX-100、礦物油購自sigma公司，EM90 oil購自ABIL公司，FastStart Universal SYBR Green Master購自Roche公司，Western印跡相關試劑購自上海碧云天公司，其他試劑為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 EDC/NHS介導的羧基和氨基偶聯反應制備蛋白-磁珠復合物 PBS洗滌羧基磁珠4次，加入5 mg EDC和5 mg NHS，室溫反應30 min，產物經磁分離洗滌后，加入5 μg APRIL蛋白，室溫反應1 h，磁分離洗滌，隨后加入1 mol/L乙醇胺封閉30 min，經磁分離洗滌后所得磁珠即為APRIL-磁珠復合物，反篩所用BAFF-磁珠復合物制備方法同上。

1.2.2 乳濁液PCR（emulsion PCR，ePCR）結合長短鏈引物擴增法制備次級文庫 取1 mL EM 90，25 μL Triton X-100和49 mL礦物油配制50 mL EM 90 oil，將文庫和EM 90 oil以1∶4（V/V）的比例混合，渦旋混勻，經PCR擴增后獲得PCR產物，PCR 程序設置為：95℃，5 min；95℃，60 s，57℃，60 s，72℃，60 s，30個循環；72℃，5 min。將PCR產物高速離心破乳，收集到PCR產物后，加入正丁醇濃縮，棄去上層油層，取下層水相，加入等體積 2×尿素變性上樣緩沖液，95℃熱變性10 min，冰浴。PCR產物為不等長的雙鏈DNA，帶有Spacer18-P2的單鏈DNA比另一條鏈長20個堿基，8%尿素變性PAGE可將兩條鏈分開，取PCR產物上樣，300 V電泳30 min后，將膠置于紫外燈下觀察，帶有FAM-P1的鏈會發出熒光，將發出熒光的目的條帶切下，經煮膠分離收集得到單鏈DNA，再用正丁醇濃縮，棄油層，取水相置于微量透析裝置中4℃透析過夜，獲得的透析產物即為次級文庫。

1.2.3 磁珠偶聯法篩選過程 將人工合成適配體文庫溶于200 μL結合緩沖液中，沸水煮沸5 min，冰浴10 min，室溫恢復10 min，加入到經結合緩沖液洗滌4次的APRIL-磁珠復合物中，室溫孵育1 h，洗滌4次后，加入200 μL結合緩沖液，煮沸10 min以洗脫磁珠上的文庫，收集到的文庫經ePCR大量擴增，長短鏈法回收后得到次級文庫，所得次級文庫經核酸定量后，投入下一輪篩選。

1.2.4 斑點印跡（dot blotting）監測篩選進程 取0.5 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）點至硝酸纖維素膜中，同時設立空白對照組；待硝酸纖維素膜干燥后，QuickBlockTMWestern封閉液封閉1 h；將處理好的生物素標記的次級文庫加到硝酸纖維素膜上，孵育2 h，Western洗滌液洗膜3次；加入1∶1 000稀釋的HRP 標記的鏈酶親和素溶液，孵育1 h，洗滌液洗膜 3 次 ；加入 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）顯色10 min，觀察膜片顯色情況。

1.2.5 適配體的高通量測序和二級結構預測 利用引物擴增文庫（文庫和第4、5、6、7輪）后，送安徽昂普拓邁公司進行高通量測序，用DNAMAN進行同源性分析并用在線工具Mfold（http：//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）預測其可能的二級結構。

1.2.6 適配體親和性和特異性的鑒定

1.2.6.1 斑點印跡 取 1 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）、1 μL BAFF 蛋 白（1 μg/μL）、1 μL BSA 蛋 白（1 μg/μL）點至硝酸纖維素膜中，同時設立空白對照組；待硝酸纖維素膜干燥后，QuickBlockTMWestern封閉液封閉1 h；將處理好的生物素標記的候選適配體加到硝酸纖維素膜上，孵育2 h，Western洗滌液洗膜3次；加入1∶1 000稀釋的HRP 標記的鏈酶親和素溶液，孵育 1 h，洗滌液洗膜 3 次 ；加入 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）顯色10 min，觀察膜片顯色情況，與對照組比較分析適配體的特異性。另取4×1 μL APRIL 蛋白（1 μg/μL）分別點至硝酸纖維素膜中，封 閉 后， 分 別 與 20 ng/μL、50 ng/μL、100 ng/μL、200 ng/μL生物素標記的候選適配體孵育2 h，再與1∶1 000稀釋的HRP標記的鏈酶親和素溶液孵育1 h，TMB顯色后觀察膜片顯色情況，陽性表明序列具有與APRIL蛋白結合的能力，分析其親和性。

1.2.6.2 酶聯寡核苷酸吸附實驗（enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA） 標記生物素的后續適配體作為一抗，HRP標記的鏈酶親和素作為二抗，測定適配體特異性：將APRIL蛋白、BAFF蛋白、BSA包被于酶標板，設置空白對照孔，加入等量的包被液，4℃過夜；洗滌液漂洗3次，加入封閉液封閉2 h，洗滌液漂洗3次；加入變性好的一抗，孵育2 h，洗滌液漂洗3次；加入1∶2 000稀釋的二抗，孵育1 h，洗滌液漂洗3次；加入TMB顯色，讀取OD450值。類似的方法測定其親和力：將APRIL蛋白包被微孔板，與不同濃度（2.5、5、10、25、50、100、200 nmol/L）的一抗反應，獲得OD450值。

1.2.6.3 qPCR法測平衡解離常數（Kd） 制備APRIL-磁珠復合物（方法同1.2.1），用等量的APRIL-磁珠復合物分別與不同濃度的候選適配體孵育30 min，熱洗脫10 min，磁分離，收集洗脫緩沖液作為qPCR的模板，用qPCR法測定洗脫緩沖液中適配體的拷貝數。

1.2.7 統計學處理 上述Dot blotting、ELONA、qPCR實驗均重復3次，采用GraphPad Prism 5統計軟件進行數據處理，組間多樣本均數采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 SELEX篩選APRIL蛋白特異性適配體

采用磁珠偶聯靶標-SELEX方法（圖1），經過7輪篩選，從隨機ssDNA文庫中篩選APRIL蛋白的核酸適配體。先將隨機ssDNA文庫與偶聯有靶標的磁珠孵育，去除大部分未能與靶標結合的ssDNA，再引入修飾后的不等長引物進行乳濁液PCR擴增，通過尿素變性PAGE分離獲得ssDNA次級文庫。在篩選過程中，優化篩選條件（表1），APRIL蛋白投入量逐漸減少，ssDNA與APRIL蛋白孵育時間逐漸減少，ssDNA投入量第一輪投入1 000 pmol，第二輪及之后調整為200 pmol。第1-3輪通過正向篩選，盡可能地富集能與APRIL蛋白特異性結合的適配體。為了增加篩選到的適配體的特異性，去除文庫中的非特異性結合序列，在第4-7輪中引入與APRIL具有高同源性的B細胞活化因子（B cell activating factor，BAFF）蛋白進行負向篩選。

圖1 適配體篩選過程Fig.1 Aptamer selection procedure

表1 表1 APRIL適配體篩選條件優化Table 1 Optimization of the selection conditions of the APRIL aptamers

2.2 候選核酸適配體的序列分析和選擇

斑點印跡鑒定第2、4、6、7輪的ssDNA次級文庫對APRIL蛋白的富集情況，Image J軟件分析顯示，第2、4、6、7輪的結合率分別為15.6%、20.1%、40.6%、38.9%，可見，隨著篩選輪數增加，ssDNA次級文庫與APRIL蛋白的結合率逐步增加，而到第7輪結合率比第6輪略低，表明篩選輪數增加不能再提高序列富集程度，可以終止篩選過程。對初始文庫和第4、5、6、7輪次級文庫進行高通量測序，獲得的序列總數分別為11.0340萬、16.0346萬、141.7842萬、203.2927萬、127.3063萬條，獲得的候選序列隨著篩選輪數增加，富集程度也一定程度的增加，選擇序列中8個頻率較高的核酸序列合成（表2）。在線軟件Mfold預測這8條候選序列的二級結構，結果顯示候選序列均具有莖環結構，且富含鳥嘌呤，其結合自由能（dG）如表2所示，Apt16的dG值最低，Apt3的dG值最高。自由能越低，表明適配體與靶分子的結合親和力越好，故優先選擇Apt16作為候選核酸適配體之一，摒棄Apt3。莖環結構通常被視為核酸適配體與靶分子的識別和結合部位，比較剩余6條候選序列，發現Apt2、Apt10莖環數目最多，進一步比較Apt2和Apt10的鳥嘌呤含量（G%），發現Apt10的G%比Apt2高，說明Apt10比Apt2更易形成G-四聯體，故選擇Apt10作為另一候選核酸適配體。最終，本研究選擇Apt10和Apt16這2條序列作為候選核酸適配體序列（圖 2）。

圖2 預測候選適配體Apt10和Apt16結構Fig.2 Predicted secondary structures of Apt10 and Apt16

表2 候選序列信息Table 2 Sequences of candidate aptamers

2.3 候選適配體Apt10和Apt16親和性和特異性分析

2.3.1 Dot-blotting分析適配體特異性和親和力 生物素標記的候選適配體Apt10和Apt16與HRP標記的鏈酶親和素作用，進行特異性分析，結果顯示（圖3），Apt10和Apt16能夠特異性結合APRIL蛋白，TMB顯色，出現不同亮暗程度的斑點，且Apt16處的斑點比Apt10處淡，BAFF、BSA和結合緩沖液無斑點出現，說明適配體Apt10和Apt16與BAFF、BSA和結合緩沖液不結合或者極弱結合，表明Apt10和Apt16具有較高的特異性，Apt10比Apt16更高。

圖3 斑點印跡法檢測Apt10和Apt16的特異性Fig.3 Specificity assays of Apt10 and Apt16 by dot-blotting

候選適配體Apt10和Apt16進行Dot-blotting親和力分析，結果顯示（圖4），隨著APRIL蛋白濃度降低，TMB顯色斑點逐漸變小變暗，當APRIL蛋白濃度低于20 ng/μL時，TMB顯色后無斑點出現。

圖4 斑點印跡法檢測Apt10和Apt16的親和力Fig.4 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by dot-blotting

2.3.2 ELONA 測定適配體的特異性和親和力分析 候選適配體Apt10和Apt16 進行ELONA特異性分析（圖5），結果表明Apt10和Apt16適配體均對APRIL蛋白顯著結合，對BAFF、BSA和結合緩沖液無反應性，結果與Dot-blotting試驗一致，說明適配體Apt10和Apt16具有顯著特異性（P＜0.001）。候選適配體Apt10和Apt16進行ELONA親和力分析（圖6），結果顯示吸光度隨生物素標記的Apt10和Apt16濃度增加而增加，結果與Dot-blotting試驗一致。GraphPad Prism 5軟件非線性回歸擬合得解離常數Kd。Apt10的Kd值為（18.40±1.47）nmol/L，Apt16的Kd值為（14.61±1.33）nmol/L。

圖5 ELONA檢測Apt10和Apt16的特異性Fig.5 Specificity assays of Apt10 and Apt16 by ELONA

圖6 ELONA檢測Apt10和Apt16的親和力Fig.6 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by ELONA

2.3.3 qPCR法測解離常數（Kd） qPCR法測得洗脫緩沖液中適配體的拷貝數，結果顯示（圖7），洗脫緩沖液中適配體的拷貝數隨著Apt10和Apt16濃度增加而增加，結果與Dot-blotting和ELONA結果一致，GraphPad Prism 5軟件進行非線性擬合，計算 得 到 Kd，Apt10的 Kd 值 為（365.90±155.60）nmol/L，Apt16的 Kd值 為（328.50±85.77）nmol/L（圖7）。qPCR法測得的Kd值與ELONA測得Kd值都在nmol/L范圍內，表明篩選得到了親和力較強的APRIL適配體。

圖7 qPCR法檢測Apt10和Apt16的親和力Fig.7 Affinity assays of Apt10 and Apt16 by qPCR

3 討論

APRIL作為TNF受體家族的重要成員，在體內外腫瘤細胞和組織中高表達，在正常組織低表達或不表達。APRIL可通過膜結合型及可溶型兩種形式促進腫瘤細胞增殖［13］。抑制APRIL活性，可有效抑制腫瘤細胞在體內外的增殖，且具有降低免疫應答的潛能［14-15］。目前尚無APRIL適配體藥物用于腫瘤的檢測與治療。

SELEX技術作為一種極其有用的分子生物學工具，經過30年的發展，在臨床診斷和疾病治療中取得了巨大的成果，篩選方法也日臻成熟，改進的SELEX 篩選方法層出不窮，但至今仍沒有固定的篩選標準［16］。結合實驗條件，本研究采用磁珠-SELEX法篩選。磁珠-SELEX是目前篩選最常用且成熟的方法，操作簡單，不需要特殊的分離設備，但篩選過程為開放性操作，在磁珠分離、單鏈制備等過程中，樣品與空氣接觸，只有幾十個堿基的分子易形成氣溶膠對后續的篩選造成污染，因此本研究引入乳濁液PCR，將水相加入油相中，形成“油包水”乳化劑，每個乳液都可作為一個微反應器，獨立平行地進行PCR擴增，避免了模板間的污染，也減少了試劑和樣品的消耗［17-18］；篩選過程中單鏈的分離也至關重要，本研究采用長短鏈法分離單鏈，PCR擴增形成的長度不同的單鏈變性后經尿素PAGE電泳分離，方法直觀、效率高，且不影響適配體的結構［19］；在篩選過程中，逐漸加大篩選壓力，如調整靶分子和次級文庫的投入量，縮短孵育時間等，以獲得與靶分子結合力更強的寡核苷酸，第4、5、6、7輪增加反篩步驟，剔除非特異性序列和特異性較差序列，保證篩選的成功率。

篩選獲得的適配體能否更好地應用于后續的研究，對其親和力和特異性進行表征是關鍵，常見的表征方法有：納米金比色法、表面等離子體共振法、流式細胞儀、等溫滴定量熱法、石英晶體微天平法、SYBR Green I染料檢測法、qPCR法、Dot-blotting、ELONA等，表征的方法很多，這些的表征方法都有一定的局限性，不同的方法可能會得到不同的結果［20］，因此本研究聯合采用Dot-blotting、ELONA、qPCR進行檢測，所得的結果是一致的，證明本研究篩選出了特異親和的APRIL適配體，ELONA與qPCR測得的Kd值不同，可能與檢測時對靶分子和適配體處理方法不同有關，如ELONA法出現靶分子與板非特異性結合，qPCR法洗脫過程中洗脫下非特異性結合序列。有研究顯示，使用分子模擬技術對獲得適配體進行優化，在保留其特異性的基礎上可以提高親和力和穩定性［21］，因此，本課題后續將對核酸適配體Apt10進行模擬優化實驗，以進一步研究適配體與靶分子的結合機制，優化適配體，為探索APRIL蛋白檢測和拮抗劑研究提供靈敏特異的識別分子。

4 結論

本研究以APRIL蛋白為靶標，采用磁珠-SELEX法進行核酸適配體篩選，篩選過程中優化篩選條件，經過7輪篩選獲得富集度高的篩選產物，對產物進行高通量測序，從測序結果中挑選出高親和力的APRIL適配體Apt10和Apt16，并對其親和力和特異性進行表征，研究結果表明篩選獲得的Apt10和Apt16均能特異性結合APRIL，親和力均在nmol/L范圍內，且Apt10優于Apt16。