WRKY轉錄因子在植物逆境響應中的作用

張桐 李智強 伍國強

（蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730050）

植物在整個生命周期中會遇到各種各樣的生物和非生物脅迫，包括病蟲害、干旱、高溫、低溫、高鹽堿和營養缺失等［1-3］。為應對這些不利環境，植物在長期的演化過程中從形態、生理、細胞以及分子水平上形成各種生存機制。轉錄因子是在基因轉錄過程中發揮重要作用的蛋白質，可以與靶標基因啟動子區域的順式作用元件結合。在已報道的植物基因組中，已經發現了幾類編碼轉錄因子的基因，其中WRKY轉錄因子是高等植物中最大的轉錄因子家族之一，能與順式作用元件W-box發生特異性相互作用。W-box主要存在于與抗病蟲害、干旱、低溫、鹽堿等相關抗性基因的啟動子區域，其通過介導激素信號轉導途徑來調控植物抗性。WRKY不僅參與植物的生長發育，而且在逆境脅迫響應中發揮重要作用。本文就WRKY的發現、結構特點、分類、調控方式、表達模式和近年來在植物響應非生物和生物脅迫中的作用研究進展進行綜述，并對未來研究方向加以展望。

1 WRKY轉錄因子的發現

WRKY是植物中最大的轉錄因子家族之一，其第一個成員發現于甘薯（Ipomoea batatas）中并命名為SPF1［4］。近年來，在許多植物中鑒定出WRKY家族成員。在不同物種中，WRKY成員數量有所差異，在油菜（Brassica napus）中發現了 343個成員［5］，而在馬尾松（Pinus massoniana）中僅鑒定到31個成員［6］（表 1）。

表1 不同物種WRKY家族成員Table 1 WRKY family members in various plant species

2 WRKY轉錄因子的結構特點、分類及調控方式

WRKY家族的命名源于其最顯著的特征：WRKY結構域，這是1個由60個氨基酸組成的區域，在家族成員中高度保守。該結構域包含1個或2個N端的WRKYGQK七肽序列和1個C端的鋅指結構。在一些植物中WRKYGQK的七肽序列也 可 以 被 WRKYGKK、WRKYGEK、WRKYGSK或WRKYDQK替代［52］。該結構域能夠與啟動子區W-box［（T）（T）TGAC（C/T）］特異結合，TGAC是W-box的核心保守序列，與WRKY轉錄因子及其下游靶點的特異性直接相關，一次突變會顯著降低結合活性，甚至完全消失。盡管WRKY對W-box具有固定的結合偏好性，但其對該元件的某些類型或排列的親和性可能會發生變化［53］。此外，它還是細胞表面受體和特化代謝基因之間的信號節點，也是網絡基序的核心組成部分；其拓撲特征往往獨立于詳細的反應機制和動力學參數，因此可以很容易的調節，以產生預期的表達動態和代謝輸出［54］。

依據WRKY七肽序列數量和鋅指結構特點可將WRKY蛋白分為3類：I類WRKY蛋白含有2個保守的WRKY七肽序列和1個C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）的鋅指結構；II類和III類WRKY蛋白都只含有1個WRKY七肽序列，不同的是II類蛋白的鋅指結構為C2H2，而III類WRKY蛋白的鋅指結構為C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）。其中大部分家族成員屬于II類WRKY蛋白，依據結構特征將其進一步分為IIa-IIe五個亞組。II、III類家族成員的單個WRKY結構域在序列上更接近于I類蛋白的C端而不是N端，說明C末端和單個WRKY結構域在功能上是等同的，構成了主要的DNA結合結構域。

大部分WRKY通過激活或抑制激素應答基因來調控植物生長和逆境脅迫。這些激素包括水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、乙烯（ethylene，ETH）、脫落酸（abscisic acid，ABA）和赤霉素（gibberellic acid，GA）等。Goyal等［41］分析了25個甘草（Glycyrrhiza glabra）GgWRKYs 在8種不同脅迫下的調控模式，有23個GgWRKYs對非生物脅迫有響應，其中17個是激素誘導的。水稻（Oryza sativa）OsWRKY36通過抑制GA信號來降低株高和籽粒大?。?5］。過量表達番茄（Solanum lycopersicum）SlWRKY23的轉基因擬南芥（Arabidopsis thaliana）對ETH、JA和GA介導的根生長表現出超敏感性，這種超敏感性與激素應答基因（ERF1和ARF5）的表達量增高密切相關，表明SlWRKY23是通過調控激素應答基因抑制擬南芥根的生長［56］。小 麥（Triticum aestivum）TaWRKY42-B通 過 與JA合成基因AtLOX3及其同源基因TaLOX3相互作用來促進葉片衰老［57］。橡膠樹（Hevea brasiliensis）HbWRKY82調控多個激素信號基因（EIN3、ABF3和ABF4）的轉錄表達，在ETH和ABA介導的葉片衰老和非生物脅迫反應中發揮重要的轉錄調節作用，并通過ETH和活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號途徑參與植株再生過程［58］。Cui等［59］在油菜中發現了一個新的WRKY轉錄因子BnaWSR1。采用凝膠遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）和染色質免疫沉淀定量 PCR（chromatin immune precipitation-quantitative PCR，ChIP-qPCR）技術研究發現，BnaWSR1直接與ICS1、Rboh 和SAG14的啟動子區結合，促進SA和ROS的合成，從而加速葉片衰老。棉花（gossypium hirsutum）GhWRKY22通過調控JA抑制因子JAZ的表達來抑制花藥和花粉發育［60］。密羅木（Myrothamnus flabellifolia）MfWRKY17過量表達顯著提高了轉基因擬南芥植株的耐鹽和抗旱性；進一步研究表明，MfWRKY17過量表達植株中的ABA響應基因（NECD3和RAB18）顯著上調，說明MfWRKY17在應激反應途徑中作為調控這些響應基因的正調控因子［61］。

3 WRKY轉錄因子的表達模式

WRKY在植物體內并非是組成型表達，而受各種環境因子（生物和非生物脅迫）的誘導［62］。Li等［16］分析了芝麻（Sesamum indicum）SiWRKYs在非生物脅迫下的表達模式，發現有33個SiWRKYs和26個SiWRKYs分別對澇漬和干旱脅迫響應強烈。鹽脅迫下，獼猴桃（Actinidia chinensis）AcWRKY29、AcWRKY40、AcWRKY48、AcWRKY55、AcWRKY95和AcWRKY96的轉錄水平升高，而AcWRKY38的轉錄水平降低［22］。Jiang等［63］在毛果楊（Populus trichocarpa）PtrWRKYs的啟動子區域發現各種與應激和防御反應相關的順式作用元件，進一步采用轉錄組測序技術（RNA sequencing，RNA-seq）分析發現，有61個PtrWRKYs受到生物和非生物脅迫的誘導。在紅薯（Ipomoea batatas）中，IbWRKY2在葉中的表達水平顯著高于莖、毛根、須根和貯藏根［64］。在馬鞭草（Verbena bonariensis）中，VbWRKY32在葉中的轉錄水平高于莖和根［65］。在橡膠樹中，HbWRKY14在乳膠中的轉錄水平顯著高于樹皮、葉、花和根［66］。這些結果表明，WRKY表達不僅受各種環境因子的誘導，而且具有一定的組織特異性。

3.1 WRKY轉錄因子在植物應答非生物逆境脅迫中的作用

植物在生長發育過程中會遇到各種非生物脅迫，包括干旱、鹽堿、極端溫度、營養缺失等，這些不利的環境條件會抑制植物的生長發育。在逆境條件下，WRKY轉錄因子調控相關逆境基因的表達，從而提高植物的抗逆性［67］。

3.1.1 對干旱脅迫的響應 干旱是限制作物生長和產量最主重的環境因素之一。長期的干旱脅迫會導致植物光合速率下降，CO2吸收減少，生物積累量和產量下降。Ma等［68］研究表明，過量表達大豆（Glycine max）GmWRKY16的轉基因擬南芥，經干旱脅迫后復水處理，存活率超過75%，其脯氨酸（proline，Pro）含量和ABA積累量均高于野生型；而丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和葉片失水率均低于野生型。Wei等［69］研究表明，過量表達GmWRKY54的轉基因大豆耐旱性明顯增強；相反，GmWRKY54 的 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）植株對干旱更為敏感。值得注意的是，GmWRKY54并非在ABA和Ca2+信號通路中調節下游干旱相關基因的表達，而是在上游激活ABA受體和SnRK2激酶，從而增強大豆的抗旱性，并提高其在干旱條件下的產量。干旱脅迫下，過量表達AtWRKY57的轉基因水稻葉片失水率、細胞死亡率、MDA含量和相對電解質滲漏率（electrolyte leakage，EL）均低于野生型，而Pro含量和ROS清除酶活性均高于野生型；進一步研究發現，在轉基因植株中，干旱脅迫應答基因（OsP5CS、OsNCED5、OsDREB1A、OsDREB2A、OsRab21和OsRab16D）的表達量均顯著提高［70］。在干旱脅迫下，過量表達杭白菊（Chrysanthemum morifolium）CmWRKY10的轉基因植株中ABA響應基 因（DREB1A、DREB2A、CuZnSOD、NCED3A和NCED3B）的表達水平明顯上調；此外，ABA積累增強了ROS活性，使得過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性增加［71］。說明CmWRKY10通過ABA信號通路調節杭白菊的抗旱能力。SlWRKY81通過調節保衛細胞H2O2介導的氣孔關閉負向調控干旱脅迫響應［72］。9-順式類胡蘿卜素雙加氧酶（9-cis-type carotenoid dioxygenases，NCED）是干旱脅迫下合成ABA的關鍵酶，NCED的過量表達可以增強ABA的積累，從而提高植物的抗旱能力。Liu等［73］利用酵母單雜交（yeast onehybrid，Y1H）、EMSA實驗和瞬時表達分析等方法，證實杜梨（Pyrus betulaefolia）PbrWRKY53能夠結合PbrNCED1啟動子區W-box元件，在干旱脅迫響應過程中發揮正調控作用。這些結果表明，WRKYs在植物應答干旱脅迫中起著重要作用。

3.1.2 對鹽堿脅迫的響應 土壤鹽堿化是世界范圍內主要的非生物脅迫之一，而農業用地的持續鹽堿化威脅著作物的產量，且在灌溉區尤為突出［74］。正常條件下，轉GmWRKY49的擬南芥與野生型植株相比生長狀況無明顯差異；但在高鹽（200 mmol/L NaCl）脅迫下，轉基因植株的成活率、蓮座直徑、EL和Pro含量均高于野生型［75］。地被菊（Dendranthema grandiflorum）DgWRKY4通過提高光合能力，促進ROS清除系統的運轉，維持膜的穩定性，增強滲透調節，上調鹽脅迫相關基因（DgDREB1A、DgDREB2A、DgCSD1和DgCSD2）的轉錄水平來提高植物的耐鹽性［76］。然而，CmWRKY17作為一個轉錄抑制因子，使得杭白菊對鹽脅迫更為敏感［77］。在高鹽條件下，過量表達葡萄（Vitis vinifera）VvWRKY30的轉基因擬南芥植株的抗氧化酶活性增強，ROS含量下降，說明VvWRKY30通過調節ROS清除系統來提高葡萄的耐鹽性［78］。在NaCl處理下，GhWRKY34通過維持Na+/K+穩態平衡，激活細胞內鹽脅迫響應基因（RD29A、ABF4、SOS1 和SOS2）等方式來適應高鹽環境［79］。Lv等［80］采用 Y1H和瞬時共轉染實驗發現，苦蕎（Fagopyrum tataricum）FtWRKY46可以特異性結合下游靶標基因啟動子區域的W-box。鹽脅迫后，外源表達FtWRKY46的轉基因植株的種子發芽率、根長、葉綠素和Pro含量均顯著高于野生型，而MDA含量則顯著低于野生型。此外，鹽脅迫相關蛋白（SOS1、SOS2、SOS3和NHX1）基因也被激活。在過量表達蘋果（Malus domestica）MdWRKY30的轉基因愈傷組織中，鹽脅 迫 響 應 基 因（ABI1、ABF3、RD22、RD29A、DREB1A、CAT1、SOD1和 VHP1）的轉錄水平顯著升高，其中ABI、ABF和RD29A被認為是非生物脅迫下ABA信號轉導的關鍵調控因子［81］。說明MdWRKY30可能通過ABA依賴的方式響應鹽脅迫。這些結果表明，WRKYs通過調控下游鹽脅迫響應基因來增強植物的耐鹽性。

3.1.3 對高溫脅迫的響應 高溫對農作物生長和產量有抑制作用，WRKY轉錄因子可提高農作物對高溫的耐受性。在高溫40℃/33℃（晝/夜）環境下，AtWRKY30過量表達小麥后，轉基因植株的相對含水量、葉綠素、Pro、可溶性蛋白和可溶性糖含量以及抗氧化酶（CAT、SOD、POX和APX）活性均顯著高于野生型，而MDA含量和H2O2水平明顯低于野生型。此外，轉基因植株中脅迫應答基因（ERF5a、DREB1、DREB3、WRKY19、TIP2和AQP7）的轉錄水平顯著上調［82］。TaWRKY33過量表達擬南芥后，轉基因植株的種子發芽率和根系生長量均高于野生型；特別值得一提的是，轉基因株系在高溫處理后的存活率超過50%，而野生型的存活率不到30%，且與脅迫相關基因（ABA1、ABA2、ABI1、ABI5和RD29A）在轉基因植株中被激活［83］。Li等［84］以AtWRKY25過量表達植株和缺失突變體植株為材料，探究了AtWRKY25在高溫脅迫響應中的作用。結果表明，過量表達AtWRKY25的植株表現出較強的耐熱性，且與熱脅迫相關基因（HsfA2、HsfB1、HsfB2a和Hsp101）的表達量顯著上調；而缺失突變體在不同生長階段對高溫表現出敏感性。Li等［85］研究發現，與野生型相比，AtWRKY25/AtWRKY26和AtWRKY25/AtWRKY33雙重突變體及AtWRKY25/AtWRKY26/AtWRKY33三重突變體植株對熱脅迫的敏感性明顯增強；相反，AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33過量表達植株耐熱能力顯著提高。進一步研究發現，AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33調控熱誘導的乙烯依賴反應過程，并在這3個基因中表現出正向交叉調控作用。由此說明，AtWRKYs正向調節熱應激反應的乙烯激活途徑，并在植物的耐熱性中發揮協同調控作用。這些結果表明，WRKYs在植物應答高溫脅迫中起著重要作用。

3.1.4 對低溫脅迫的響應 低溫被認為是限制作物產量主要的非生物脅迫之一。Li等［21］在毛竹（Phyllostachys edulis）中發現了121個PheWRKYs 成員，并對81個PheWRKYs在低溫脅迫下的轉錄水平進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析發現，有28個基因受到低溫脅迫的上調或下調。在紅梅（Prunus mume）PmWRKYs成員中，受到冷脅迫上調和下調2倍以上的基因數分別為6個和11個［33］。OsWRKY71過量表達水稻后，轉基因植株在低溫脅迫（4℃以上）下的存活率、光合速率和干鮮重都明顯高于野生型植株［86］。Wang等［65］研究表明，在低溫脅迫下，VbWRKY32過量表達轉基因植株的Pro和可溶性糖含量及抗氧化酶活性顯著提高，而EL、MDA、H2O2、O2-積累量明顯降低；此外，轉基因植株中低溫響應基因（VbSOD、VbPOD、VbCAT、VbAPX6、VbAMY3、VbBAM1 和VbP5CS）的轉錄水平均上調。Yokotani等［87］利用離子滲漏實驗發現，在低溫（4℃）條件下，過量表達OsWRKY76的轉基因水稻葉片中的離子滲漏明顯低于野生型。說明OsWRKY76可通過保護細胞膜免受損傷而賦予水稻耐寒性。茄子（Solanum melongena）SmWRKY26和SmWRKY32可以正向調控冷脅迫響應［51］。

3.1.5 對營養缺失的響應 植物在生長發育過程中需要各種營養元素，包括大量元素和微量元素。而營養虧缺會誘發植物葉片褪綠和生長缺陷。迄今為止，已報道的與營養元素脅迫相關的WRKY轉錄因子甚少，且以磷（phosphorus，P）、氮（nitrogen，N）、鐵（ferrum，Fe）和鋅（zinc，Zn）為主。P是植物生長發育必需營養元素之一，在植物生命周期中扮演著多重功能，它還是關鍵分子（如ATP、核酸和磷脂）的組成成分［88］。在P虧缺條件下，過量表達海島棉（Gossypium barbadense）GbWRKY1的轉基因擬南芥植株 Pi饑餓癥狀減弱［89］。Dai等［90］研究表明，過量表達OsWRKY74顯著增強了轉基因植株對Pi饑餓的耐受性；此外，還發現OsWRKY74過量表達植株對Fe、N等營養物質虧缺脅迫有著不同的反應，與Pi脅迫類似，Fe脅迫顯著增強了OsWRKY74的表達，而N脅迫抑制了OsWRKY74的表達。在缺P條件下，AtWRKY45過量表達株系中磷酸轉運蛋白（phosphate transporter1；1，PHT1；1）表達增強；而AtWRKY45-RNAi株系中PHT1；1的表達被輕微抑制［91］。由此說明，AtWRKY45通過上調PHT1；1的表達而增強擬南芥對P虧缺的耐受性。此外，AtWRKY25和AtWRKY33的異源表達對Zn轉運蛋白ZIP3和ZIP4的轉錄水平沒有顯著性影響，但卻抑制了植物在Zn虧缺條件下的生長缺陷［92］。上述結果說明，WRKYs在植物響應營養元素虧缺方面扮演著重要角色。

3.1.6 對其他非生物逆境脅迫的響應 植物除了受干旱、鹽堿、高溫、低溫和營養缺失脅迫外，還受到其他非生物脅迫，如離子脅迫、激素脅迫和損傷脅迫等。高濃度NH4+對植物組織有毒害作用，可導致多種反應。Gao等［93］研究表明，在NH4+毒害下，AtWRKY23突變體中的銨轉運蛋白（ammonium transporters 1；2，AMT1；2）被誘導，致使NH4+在根中大量積累，最終出現主根生長緩慢、側根數量減少和葉片萎黃等現象。鋁（aluminum，Al）是地殼中含量最豐富的金屬之一，當pH值低于5時，Al3+會抑制作物根系的伸長、水分和養分的吸收。Chun等［94］研究表明，AtWRKY47的缺失突變可顯著降低植株對Al3+耐受性，而過量表達則可增強植株的耐鋁性。OsWRKY22通過與檸檬酸轉運蛋白的W-box結合，促進Al3+誘導檸檬酸分泌，從而提高水稻對Al3+脅迫的耐受性［95］。番茄SlWRKY42直接與Al3+耐受基因SlALMT9啟動子區域的W-box結合，改變SlALMT9的表達水平，負向調控Al3+脅迫響應［96］。AtWRKY13過量表達使轉基因植株體內鎘（cadmium，Cd）積累量減少，從而增強對Cd的耐受性；而AtWRKY13缺失突變使Cd積累量增加和敏感性增強［97］。在黃麻（Corchorus capsularis）中，21個CcWRKYs對GA脅迫有響應。通過順式作用元件（cis-acting element）分析表明，這些CcWRKYs啟動子中有GARE-motif、P-box和TATC-box等與GA反應相關的順式作用元件，可以提高黃麻的株高等性狀。由此說明CcWRKYs參與GA脅迫下韌皮纖維損傷的發育［46］。Kang等［98］研究表明，過量表達HbWRKY83能顯著提高損傷反應基因HbEIN3s和ROS清除系統相關基因的表達水平，對橡膠生產起到正向調控作用。

3.2 WRKY轉錄因子在植物響應生物逆境脅迫中的作用

生物逆境脅迫包括病原菌的侵染和植食性昆蟲的取食，為了應對這些脅迫，植物進化出了包括信號感知和轉導、基因表達調控和生理生化反應在內的響應機制，其中WRKY轉錄因子的表達在獲得性抗性中發揮了重要作用。

3.2.1 對病原菌脅迫的響應 WRKY已被證實在植物應答病原菌中發揮重要作用。一些WRKY在植物對病原菌脅迫的防御中起正向調控作用。在菊花中，CmWRKY15的過量表達可增強轉基因植株對柄銹菌（Puccinia horiana）的耐受性，且內源SA含量也增加；相反，CmWRKY15-RNAi植株增加了對柄銹菌的敏感性，內源SA含量降低［99］。說明CmWRKY15通過影響SA信號途徑在菊花對柄銹菌的抗性中發揮正向調控作用。過量表達MdWRKY100能增強轉基因蘋果植株對炭疽病菌（Colletotrichum）的抗性，而RNAi植株對炭疽病菌更敏感［100］。過量表達CaWRKY27的轉基因辣椒（Capsicum annuum）對青枯?。≧alstonia solanacearum）的抗性增強；相反，病毒誘導的CaWRKY27基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）增強了辣椒對青枯病的敏感性［101］。由此可見，CaWRKY27在辣椒對青枯病感染的抗性應答中起正向調節作用。Wang 等［102］研究發現，芍藥（Paeonia lactiflora）PlWRKY65對細鏈孢霉（Alternaria tenuissima）感染具有正向調控作用。當細鏈孢霉感染時，該基因表達水平上調；而PlWRKY65-VIGS植株比野生型植株對細鏈孢霉感染更為敏感，表現出更嚴重的感染癥狀。與空載體轉基因植株相比，沉默GmWRKY40的大豆毛狀根對大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）感染的敏感性增強［103］。Liu 等［28］研究發現，月季（Rosa chinensis）RcWRKY41在灰霉病（Botrytis cinerea）侵染的早期到晚期其表達均呈上升趨勢，而RcWRKY41沉默植株對灰霉病的抗性降低。

另外，也有些WRKY 轉錄因子在植物對病原菌脅迫的防御中起負向調控作用。TaWRKY3是抗病抑制因子，SnRK1通過磷酸化和破壞TaWRKY3阻遏子的穩定性提高小麥對白粉?。˙lumeria graminis）的免疫力［104］。過量表達OsWRKY76使得轉基因水稻對稻瘟病（Magnaporthe oryzae）的敏感性增強［87］。Zheng 等［105］研 究 表 明，AtWRKY25 在 SA介導的紫丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）防御反應中發揮負調控作用。過量表達AtWRKY25的轉基因植株對紫丁香病菌的敏感性增強，病原菌感染后，AtWRKY25兩個獨立的T-DNA插入突變體植株表現出較輕的病癥。相類似的是，AtWRKY38或AtWRKY62的過量表達降低了擬南芥對紫丁香假單胞菌的抗性，而突變體對紫丁香假單胞菌的抗性增強［106］。可見AtWRKYs在擬南芥對紫丁香假單胞菌的抗性起負向調控作用。這些結果表明，WRKYs通過正向調控和負向調控方式參與植物對病原菌脅迫的防御。

3.2.2 對植食性昆蟲脅迫的響應 大多數WRKY轉錄因子在逆境環境或病原菌感染等相關刺激下被轉錄誘導，而在蟲害脅迫下誘導表達的WRKY 轉錄因子報道較少。植物寄生線蟲（nematodes）可以通過影響寄主基因的表達來建立取食位點，最終會影響植物的生長和發育［107］。擬南芥被根結線蟲（Meloidogyne）和胞囊線蟲（Heterodera）感染后，AtWRKY23的表達迅速上調；而AtWRKY23基因敲除植株對胞囊線蟲的敏感性下降［108］。此外，還發現AtWRKY23的表達是由植物生長素誘導的。表明生長素誘導基因AtWRKY23參與植物和寄生線蟲的相互作用。Skibbe等［109］研究發現，NaWRKY3和NaWRKY6在煙草（Nicotiana attenuata）對食草動物的抗性中起著至關重要的作用，NaWRKY3和NaWRKY6-VIGS植株在溫室和自然界中更容易受到食草動物的傷害。Atamian等［110］發現SlWRKY70-VIGS會增強番茄對蚜蟲（Macrosiphum euphorbiae）的抗性，說明SlWRKY70在番茄對蚜蟲的抗性中起負向調控作用。相反，AtWRKY22通過抑制SA信號通路增強擬南芥對蚜蟲的敏感性［111］。胰蛋白酶抑制劑（kunitz trypsin inhibitor，KTIs）被認為是對抗昆蟲、食草動物和病原體的天然防御蛋白。沉默NaKTI2使煙草上的斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲具有更高的存活率。EMSA實驗表明，NaWRKY3和NaWRKY6在體外可以直接與NaKTI2的啟動子區結合，說明NaWRKYs可直接激活NaKTI2的轉錄，從而提高煙草的抗蟲性［112］。

3.3 WRKY轉錄因子在植物生長發育中的調控作用

WRKY轉錄因子除響應生物和非生物脅迫外，還參與了植物的生長、發育、衰老和碳水化合物及次生代謝產物的合成［113］。OsWRKY29敲除和RNAi株系都增強了種子休眠，而過量表達株系的種子休眠減弱。ABA處理后，OsWRKY29敲除和RNAi株系比其過量表達株系表現出更強的敏感性［114］。由此說明，OsWRKY29作為ABA信號抑制因子來參與調控種子休眠。人參（Panax ginseng）PgWRKY6沉默顯著阻礙了胚性愈傷組織的誘導率，表明PgWRKY6可能促進胚性愈傷組織的發育［115］。臘梅（Chimonanthus praecox）CpWRKY71參與了調控植株開花和葉片衰老過程［116］。Hu等［117］通過EMSA和ChIP-qPCR實驗發現 MdWRKY72通過結合MdHY5啟動子區的W-box元件間接或直接促進MdMYB1的表達，從而增強花青素合成能力。Qu等［118］通過Y1H和EMSA分析發現，HbWRKY27正向調控天然橡膠關鍵生物合成基因HbFPS1的表達。板藍根（Isatis indigotica）Ii4CL3被證實是木脂素生物合成的核心基因；通過EMSA和雙熒光素酶（Dual-luciferase，Dual-LUC）實驗表明，IiWRKY34通過結合啟動子而激活Ii4CL3的轉錄［119］。HbSRPP是一種含量豐富的橡膠顆粒相關蛋白，是橡膠樹合成天然橡膠的輔助因子。HbWRKY14可以與HbSRPP的啟動子結合，并表現出抑制HbSRPP啟動子的能力［66］。說明HbWRKY14是橡膠合成的負調控因子。Hao等［120］通過EMSA、Y1H和Dual-LUC等實驗發現，短小蛇根草（Ophiorrhiza pumila）OpWRKY2直接結合并激活喜樹堿核心通路基因OpTDC，作為喜樹堿生物合成的正向調節因子。二苯乙烯類是重要的植物抗毒素，通過酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2H）和雙分子熒光互補（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）實驗表明，VqWRKY53通過調節VqMYB14和VqMYB15互作來增強二苯乙烯合成［121］。VviGT14是與酵母型葡萄漿果中糖基化單萜類物質積累相關的關鍵基因，VviWRKY40作為轉錄抑制因子參與VviGT14的轉錄調控［122］。EMSA實驗表明，PgWRKY4X與角鯊烯環氧化酶（squalene epoxidase，SE）啟動子的W-box結合，而PgSE可以上調人參皂苷生物合成基因［123］。說明PgWRKY4X可正向調控人參皂苷的生物合成。荷花（Nelumbo nucifera）NnWRKY40a和NnWRKY40b促進芐基異喹啉類生物堿（benzylisoquinoline alkaloid，BIA）的合成［29］。說明WRKYs除響應脅迫環境外，還在植物生長發育，以及物質代謝方面發揮著重要作用。

4 展望

WRKY轉錄因子主要存在于高等植物中，且在植物響應生物脅迫和非生物脅迫以及生長發育中發揮著重要作用。然而，關于對WRKYs的功能和調控機理我們認識還很有限，諸如WRKYs在不同抗逆性作物品種中的表達模式是否存在差異；其通過調控哪些下游靶標基因來維持作物體內離子穩態平衡及對抗逆性有何影響等問題，尚需深入研究。另外，WRKYs自調節模式以及涉及信號通路間的串擾和相互協調機制也有待于進一步探究。隨著基因工程技術（過量表達、RNAi、miRNA和基因編輯等）的發展，WRKY 轉錄因子響應逆境脅迫的信號轉導通路和作用機制將被闡明，可為農作物的抗逆性遺傳改良提供理論支持與優異基因資源。