地衣芽孢桿菌KD-1β-甘露聚糖酶定點突變提高酶活性及穩定性

田庚 高偉強 陳曉波 張春曉

（河北科技大學生物科學與工程學院，石家莊 050018）

β-甘露聚糖酶，又名內切-1，4-β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78），通過隨機水解甘露糖多聚物的β-1，4-糖苷鍵對甘露聚糖進行水解［1-2］。β-甘露聚糖酶在多種工業領域中都有所應用［3］，如作為飼料添加劑在養殖業中，通過降解抗營養因子β-甘露聚糖，提高飼料利用率［4］；在造紙工業，β-甘露聚糖酶能提高紙漿白度，改善紙漿性能［2，5］；應用于洗滌業，能夠有效去除基于食品的染色［6］；應用于食品行業，能夠防止面團的水分散失，維持面團的拉伸能力［7］，有效降低咖啡提取物的黏度［8-9］，對果汁進行澄清等［10-12］。此外，β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖的水解產物為，包含2-10個甘露單糖分子的線性和分支狀寡甘露聚糖（MOS），作為功能性食品被應用于醫藥領域［13］。如MOS能夠刺激腸道益生菌乳酸菌（Lactobacilli）和雙歧桿菌（Bifidobacteria）的生長，抑制病源微生物的生長［2，14］，MOS還具有許多其它生物功能，如增強免疫、抗癌、維持心血管健康和增強脂肪代謝等［14-15］。

由于抗生素過量使用造成的潛在危害，全球多個國家已禁止或限制抗生素作為飼料添加劑使用，我國已于2020年7月全面禁止在動物養殖過程中使用抗生素作為飼料添加物。因此，研發抗生素替代產品尤為重要。β-甘露聚糖酶不僅能夠提高飼料利用率，其水解產物MOS能夠調節動物腸道健康，增強動物免疫力［4，13］，可作為良好的抗生素替代產品。盡管β-甘露聚糖酶廣泛存在于植物、細菌、真菌和無脊椎動物中［1］，多種不同的β-甘露聚糖酶基因也已經克隆，不同酶的特征也做了鑒定［2，8，16-17］，但仍不能滿足不同領域的精細化需求［2］，開發酶學活性高、穩定性高的β-甘露聚糖酶尤顯重要。

來自于Bacillus lichenifromis DSM 13的β-甘露聚糖酶屬于糖苷水解酶（GH）26家族，具有典型的（β/α）8 折疊結構，有淺盤狀活性中心［18］，與來自于枯草芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶BCman（2qha）［19］和Bman26［2］具有相似的結構，具有很高的熱穩定性［1，17］，在 50℃酶的半衰期超過 80 h［1］。本研究對來自于B. lichenifromis KD-1的β-甘露聚糖酶基因進行克隆，進行定點突變，以期獲得酶學活性和穩定性提高的β-甘露聚糖酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和化學試劑 從土壤中分離得到B. licheniformis KD-1，目前保存在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號 CGMCC No. 18964。B.subtilis DB104 和質粒pWB980 為加拿大Wong教授所贈［20-21］，用于構建克隆載體的pGEMTeasy載體購自Promega公司，其他質粒列于表1，所用菌株列于表2。

表1 本研究中所用質粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究中所用菌株Table 2 Strains used in this study

應用全式金公司的Fastpfu或HifiTaq酶進行PCR擴增，所用引物見表3。

表3 本研究所用引物Table 3 Primes used in this study

1.1.2 培養基 培養B. licheniformis KD-1所用培養基為KGM培養基（KH2PO40.1%，MgSO40.01%，蛋白胨 0.5%，魔芋膠 0.5%，固體培養基額外添加1.5%的瓊脂粉），B. subtilis 轉化子的篩選為LB培養基中加入10 mg/L 的卡那霉素。枯草芽孢桿菌工程菌株的發酵培養基為SRM（super-rich medium，2.0%酵母粉，2.5%蛋白胨，0.3% K2HPO4和 3.0%葡萄糖）［2］。

1.2 方法

1.2.1 B. subtilis DB104感受態制備及轉化 參考文獻［22］進行枯草芽孢桿菌感受態細胞的制備，1-2 μg PCR產物轉化入0.5 mL感受態細胞中，用含卡那霉素的LB培養基進行轉化子的篩選。

1.2.2 β-甘露聚糖酶基因分子克隆及B. subtilis DB104表達載體構建 根據已報道的地衣芽孢桿菌β-甘露聚糖酶基因序列，設計簡并引物Bl man2-F1和BL man2-R1，以B. licheniformis KD-1基因組為模板，克隆B. licheniformis KD-1 β-甘露聚糖酶基因manBl。純化的PCR產物與pGEMTeasy載體連接，并送華大基因公司進行測序。構建manBl 基因在Bacillus subtilis DB104中的表達載體過程如下，應用BL man2-F2 和 manBT-2引物，以B. licheniformis KD-1基因組為模板，擴增不包含信號肽序列的manBl-sigP基因；以amyT-F 和amyT-R為引物擴增B.subtilis DB104 α-淀粉酶基因的終止子（amyT）；以等摩爾的manBl-sigP和amyT 為模板，以spmanB-F和amyT-R為引物，進行 manBl-sigP-amyT融合基因的擴增；以Pvf-1 和 Pvf-2p為引物對pWB980質粒進行線性化；將等摩爾的manBl-sigP-amyT和線性化的pWB980，通過POE-PCR方法［23］構建manBl在枯草芽孢桿菌中的表達載體pWB-manBl。

1.2.3 β-甘露聚糖酶基因理性突變及篩選 基于對ManB、BCman（2qha）和 Bman26三種β-甘露聚糖酶相似的三維結構［2，18-19］，參照Bman26獲得的3個高酶活性突變體（K291E、L211I和 T112R）［2］，在相同的氨基酸位點對地衣芽孢桿菌KD-1的manBl基因進行理性突變。突變體ManBl（K291E）基因通過3步PCR克隆得到，第一步，通過引物R-manBl-F和 DR-manBl-R克隆基因的5′端；第二步，通過引物DR-manBl-F 和 R-manBl-R克隆該基因的3′端；第三步，通過引物R-manBl-F 和 R-manBl-R，以第一步和第二步獲得的5′端和3′端PCR產物為模板，獲得突變體manBl（K291E）基因。突變體ManBl（L211I）和manBl（T112R）采用相同的策略進行克隆，融合引物分別為BL-L211I-R和BL-L211I-F或 BL-T112R-R 和BL-T112R-F。載體的線性化以V-manBl-F和V-manBl-R為引物，pWB-manBl為模板，通過PCR克隆獲得，PCR產物manBl（K291E），manBl（L211I）和 manBl（T112R）分別與線性化pWB-manBl載體通過POE-PCR進行連接［23］，獲得相應的載體。manBl雙位點突變基因K291E/L221I，K291E/T112R/和L211I/T112R采用上述相似策略獲得。

1.2.4 工程菌株的發酵培養 對枯草芽孢桿菌工程菌株 MTV13、ABV3、T2、L4、LK2、TL1、TK7、A3和C5（表2）等，挑取單克隆至LB（含10 mg/L 的卡那霉素）培養基，37℃，200 r/min過夜培養，按10%比例轉接至 SRM 培養基（含10 mg/L的卡那霉素），250 mL搖瓶發酵。

1.2.5 酶活性測定方法 采用3，5二硝基水楊酸的方法對β-甘露聚糖酶活性測定［24］，底物為0.5%（W/V）的魔芋膠（KGM），溶于pH 6.0的磷酸緩沖液中。適當稀釋的酶液30 μL與 270 μL 的底物混勻，60℃ 孵育 10 min，加入600 μL DNS試劑混勻，煮沸5 min，立刻冰水浴中冷卻10 min，在SpectraMaxm i3x多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）測540 nm吸收值。以不同濃度D-甘露糖做標準曲線。每組重復3次。

酶活性定義：在一定溫度和pH下，以每分鐘催化底物水解生成1 μmol D-甘露糖所需的酶量定義為一個酶活性單位（U）［1］。

1.2.6 酶的生物化學特征測定方法 將稀釋的不同酶液與底物（0.5%KGM 于pH 6.0磷酸緩沖液）在不 同 溫 度（30、40、50、55、60、65、70、80和90℃）反應10 min，測量殘余酶活性，以確定酶反應的最適溫度。將酶液用pH 6.0磷酸緩沖液適當稀釋后，在70℃ 孵育 30 min，再按1.2.5方法測定酶活性，計算相對殘余酶活性以確定酶的熱穩定性［25］。

配制 pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0緩沖液，與等量粗酶液混合，在37℃條件下保溫30 min。取出酶液使其與0.5% KGM混合，按1.2.5方法進行酶活性測定，計算相對殘余酶活性以確定酶的pH穩定性［25］。

為了確定金屬離子對酶活性的影響，將酶液用pH 6.0的磷酸緩沖液適當稀釋后，分別與10 mmol/L K+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Na+、Cu2+和 Mg2+等 不 同 金屬離子溶液等體積混合，在37℃條件下保溫1 h，以未加金屬離子的酶液作為對照［5］，再按1.2.5的方法測定β-甘露聚糖酶活性，計算相對殘余酶活性以確定金屬離子對酶活性的影響［25］。

為評估酶的動力學參數Km和Vmax，以溶于pH 6.0 的1-10 mg/mL KGM 作為底物，分別與適當稀釋的酶液反應，按1.2.5方法測定酶活性［2］，采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算Km和Vmax值。

1.2.7 SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白濃度定量 枯草芽孢桿菌工程菌株目的基因表達與分泌采用SDSPAGE凝膠電泳進行檢測，發酵后12 000 r/min 離心10 min，發酵液上清與5×上樣緩沖液混合，煮沸10 min進行電泳。通過與標準蛋白比較條帶面積及著色程度，應用AlphaView 軟件（Naturegene Corp，USA）對目的蛋白進行定量。

1.2.8 蛋白純化和定量 帶有His標簽的蛋白采用全式金蛋白純化試劑盒按說明書進行純化，純化后蛋白采用Lowry蛋白測定試劑盒（索萊寶公司）按說明書進行蛋白定量。

1.2.9 manBl基因序列分析和蛋白結構分析 本研究的測序均送華大基因進行測序。manBl基因序列和蛋白質序列與GenBank 數據庫進行BLAST比對。蛋白質的基本性質如分子量、等電點pI采用在線軟件 Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/） 進行分析，采用 在線SignalP-5.0預測信號肽序列［26］。應用I-mutant 2.0在線軟件預測突變株單個氨基酸替換后的DDG值［27］，應用在線Interpro進行蛋白質保守結構域的分析［28］。ManBl及其突變株蛋白四級結構應用在線SWISS MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）同源模型進行推斷。

1.2.10 基因序列注冊號 地衣芽孢桿菌KD-1β-甘露聚糖酶基因序列提交至GenBank，基因序列注冊號為MW484945。

2 結果

2.1 基因克隆及序列分析

從B. licheniformis KD-1克隆的β-甘露聚糖酶基因（manBl）大小為1 083 bp，如圖1泳道1所示。該序列在GenBank數據庫中未找到與之100%一致的DNA序列，與B. licheniformis 其他菌株如ATCC14580（CP034569.1）、DSM13（AE017333.1）、KNU11（CP042252.1）和 CSL2（CP041154.1）等菌株存在99.8%（2個核苷酸差別）一致性，這2個核苷酸分別位于第11和1 074位，編碼蛋白質的第4和358位的氨基酸。

圖1 β-甘露聚糖酶PCR結果Fig. 1 The β-mannanase gene PCR product

manBl基因編碼360個氨基酸，氨基酸序列BLAST結果表明，與B. licheniformis ATCC 14580或 DSM13、Bacillus sp. SL1等β-甘露聚糖酶一致性99.72%，經ProtParam軟件預測，成熟蛋白分子量38.2 kD，pI為5.01。經SignalP-5.0軟件預測，前24位氨基酸為信號肽序列，信號肽類型為Sec/SPI型。保守結構域分析該蛋白屬于糖苷水解酶家族26（GH26），編碼產物為內 1，4-β-糖苷酶（EC 3.2.1.78）。

2.2 manBl基因及其突變體在B. subtilis DB104中的表達

應用引物BL man2-F2 和 BL man2-R1克隆β-甘露聚糖酶成熟肽基因，PCR產物1 011 bp，如圖1泳道2所示。β-甘露聚糖酶及其突變體基因受枯草芽孢桿菌組成型強啟動子P43驅動，信號肽為SacB，各蛋白在B. subtilis DB104中的分泌表達如圖2所示。結果表明，目的蛋白為發酵液中的主要蛋白，估測占總蛋白量的90%以上。

圖2 β-甘露聚糖酶基因及突變體在枯草芽孢桿菌中的表達Fig. 2 β-mannanase gene and its variants expression in B.subtilis

2.3 β-甘露聚糖酶及其突變體的酶學性質

2.3.1 pH的影響 圖3-A結果表明，ManBl及6個突變體K291E、L211I、T112R、T112R/L211I、L211I/K291E和T112R/K291E 的最適pH為6.0，所有突變體在pH 6.0-10.0之間pH穩定性高于野生型，殘余酶活性超過78%，特別是突變株ManBl（K291E），展示出良好的堿穩定性，在pH 11.0時，殘余酶活性還有76%，是一株較好的堿穩定性的酶。

2.3.2 溫度的影響 ManBl 及6個突變體的最適溫度為60和80℃時仍保留30%以上的酶活性（圖3-B）。將ManBl 及6個突變體在70℃ 孵育30 min，酶的熱穩定性如圖3-C所示，ManBl三個單位點突變體T112R、L211I 和 K291E，酶的熱穩定性降低，其中，ManBl（L211I）明顯降低了酶的熱穩定性，其穩定性僅為野生型ManBl的41%。包含L211I的3 個突變株，ManBl（L211I）、ManBl（L211I/K291E）和ManBl（T112R/L211I）殘余相對酶活性分別為30%、31%和39%（圖3-C）。

2.3.3 金屬離子的影響 除ManBl（T112R）酶活性受到K+和 Cu2+激活外，ManBl及其5個突變體的酶活性均受到所研究的金屬離子不同程度地抑制（圖3-D）。

圖3 β-甘露聚糖酶酶學性質研究Fig. 3 Properties of β-mannanase and its variants

2.3.4 β-甘露聚糖酶活性 β-甘露聚糖酶ManBl及其6個突變體酶活性在無添加金屬離子、pH 6.0、60℃條件下進行比較，如圖4-A表示，ManBl及其6個突變體酶活性前4 d持續積累，到第4天達到最高值（圖4-A），第5天酶活性開始下降（數據未顯示）。酶的突變體除ManBl（T112R/L211I）外，最大酶活性均高于野生型，其中突變體ManBl（K291E）酶活性為7 328.3±138.1 U/mL，是野生型的1.25倍；另外兩個突變株，ManBl（L211I）和 ManBl（T112R/K291E）酶活性均超過6 800 U/mL。盡管單位點突變株 ManBl（T112R）和 ManBl（L211I）的酶活性較野生型高，但雙突變體ManBl（T112R/L211I）酶活性反而較野生型下降（圖4-A）。

由于受生長過程中細胞密度、目的蛋白分泌程度等各因素影響，單純對酶活性（U/mL）測定并不能完全反應突變體的酶學性質，因此，進一步通過比活力對ManBl及其6個突變體進行比較。結果如圖4-B所示，2個單位點突變株ManBl（K291E）和 ManBl（T112R），2個雙位點突變株ManBl（L211I/K291E） 和 ManBl（T1122R/K291E），比活力均高于野生型ManBl（3 750±153.4）U/mg，其中T1122R/K291E和K291E是野生型的 2.60 和1.81倍，特異酶活性分別為（9 742±370.0）U/mg和（6 790±100.4）U/mg（圖4-B）。3個單位點突變株T112、L211I 和 K291E的特異酶活性也較野生型ManBl有所提高。

圖4 ManBl及突變體的酶活性Fig. 4 Enzyme activity of manBl and its variants

ManBl及6個突變株在與底物親和能力方面表現也不同，表4為ManBl及6個突變體的Km及Vmax值。野生型ManBl 的Km值為3.80 mg/mL，突變株ManBl（T112R/K291E）比野生型ManBl有較低的Km（2.67 mg/mL），說明與底物親和能力更高；其它突變株則在與底物親和能力方面較野生型稍差（表 4）。除了突變體 ManBl（L211I）的 Vmax低于野生型之外，其他突變體的Vmax均高于野生型，其 中 突 變 體 ManBl（T112R/L211I） 的 Vmax最 大，為 0.951 μg/s。

表4 ManBl及其突變體的動力學參數Table 4 Kinetic parateters of ManBl and its variants

2.4 ManBl-His和ManBl（T112R/K291E）-His酶活性及熱穩定性

為便于蛋白質的純化，一般將蛋白質加上一些標簽，如His標簽等。本研究將野生型β-甘露聚糖酶ManBl和突變株ManBl（T112R/K291E）在C端加上6個His，純化后進一步測定酶活性和熱穩定性，純化結果如圖5所示，純化后突變株ManBl（T112R/K291E）-His 的比活力為（2 283.8±49.6）U/mg，高于野生型ManBl-His的比活力（1 679.1±202）U/mg，均低于相應的不帶His標簽的ManBl（T112R/K291E）和ManBl；說明C端的His標簽降低了酶活性。

圖5 蛋白純化結果Fig. 5 Protein purification results

本研究進一步比較了His標簽對酶熱穩定的影響，結果如圖6所示。不帶His標簽的ManBl及ManBl（T112R/K291E）在70℃的熱穩定性均高于相應的帶有His標簽的酶，ManBl 70℃半衰期為150 min，遠高于其帶His標簽的酶ManBl-His的半衰期20 min（圖 6）；另外，ManBl（T112R/K291E）70℃的半衰期80 min，雖低于ManBl的半衰期，但也遠高于其帶His標簽的酶ManBl（T112R/K291E）-His 15 min（圖6）。這些結果表明，C端His標簽降低了酶的熱穩定性。

圖6 ManBl及其突變體的熱穩定性Fig. 6 Thermal stability of ManBl and its mutants

3 討論

通過基因突變對酶進行定向改造是一種快速獲得酶學性質提高的有效方法［2，29］，如將B. subtilis TJ-102的β-甘露聚糖酶ManTJ102通過理性設計將酶的熱穩定性提高了24倍，60℃半衰期達120 min［29］。基于對來自不同菌株的β-甘露聚糖酶結構分析，如地衣芽孢桿菌ManB［18］、枯草芽孢桿菌BCman（2qha）［19］和 Bman26［2］，盡管酶的氨基酸序列有差異，但三維結構相似。本研究對來自地衣芽孢桿菌KD-1菌株的ManBl基因進行了改造。結果表明，改造后的β-甘露聚糖酶突變體在酶活性、pH穩定性、熱穩定性及與底物結合能力方面都發生了變化。應用I-mutant軟件［27］對單氨基酸位點突變后DDG值的預測結果表明，L211I和K291E的DDG值分別為-1.29和-1.06，意味著這2個突變體 ManBl（L211I）和 ManBl（K291E）的熱穩定性降低，與實驗結果完全一致；盡管突變體ManBl（T112R）的DDG值為0.11，但實驗結果表明該突變株的熱穩定性并未增加。突變體β-甘露聚糖酶ManBl（K291E），不僅酶活性提高（6 789.6±100.4）U/mg，是野生型的1.8倍，且在中性至堿性pH范圍（pH 7.0-11.0）內，突變體的pH穩定性遠高于野生型，比從Klebsiella pneumoniae SS11中分離的堿和熱穩定的β-甘露聚糖酶（ManSS11）的堿穩定性更好，其在pH 7.0-10.6之間殘余相對酶活性大于70%，在pH 11.0時殘余相對酶活性不到50%［6］，遠低于本研究man（K291E）的堿穩定性；突變體ManBl（T112R/K291E）酶活性是野生型的2.6倍，且與底物親和能力提高，熱穩定性在70℃半衰期達80 min，pH 5.0-10.0之間具有良好的穩定性，pH 4.0環境下殘余酶活性小于60%，該酶直接飼喂動物時受胃酸作用酶活性部分喪失，因此酶可對飼料進行預處理，或與菌協同作用制備發酵飼料。此外，突變體ManBl（T112R/K291E）雖然酶活性稍低于B.subtilis WL-7 的 β-甘露聚糖酶 10 080 U/mg［30］，但熱穩定性遠高于B. subtilis WL-7的β-甘露聚糖酶，其在 70℃ 1 h 殘余酶活性不到 30%［30］。Zhou 等［31］比較了來自芽孢桿菌屬的β-甘露聚糖酶性質，綜合酶活性、熱穩定和pH穩定性來看，地衣芽孢桿菌β-甘露聚糖酶突變體ManBl（T112R/K291E）在酶活性及穩定性方面高于其他β-甘露聚糖酶，展現了良好的工業應用潛力。

本研究中ManBl最適溫度60℃，在80℃仍有50%的酶活性，且70℃孵育30 min后殘余酶活性為73%，與來自B. licheniformis DSM13 β-甘露聚糖酶報道的最適溫度50℃有一定差距，且當ManB1溫度達到80℃已無酶活性，70℃ 保溫30 min酶活性亦喪失［1］。經BLAST比對分析，B. licheniformis DSM13 β-甘露聚糖酶成熟肽氨基酸序列與本研究的KD-1菌株β-甘露聚糖酶序列一致，但是實驗結果卻存在如此大的差異。進一步分析發現，ManB在C末端加了6個His標簽，為了驗證是否His標簽影響了β-甘露聚糖酶的性質，本研究將ManBl和ManBl（T112R/K291E）C末端加上了6個His做進一步分析。通過對ManBl-His和ManBl（T112R/K291E）-His的酶活性及70℃熱穩定的測定，結果表明，His標簽的確降低了酶活性和熱穩定性。來源于B. subtilis Z-2的β-甘露聚糖酶結構及功能分析結果表明，N端His1和C端Glu336能夠結合Zn2+，對酶的穩定性起重要作用［19］。Zn2+和 Ni2+也在 B. licheniformis DSM13的β-甘露聚糖酶中檢測到，說明有相似的金屬結合位點，對酶的熱穩定性有影響［18］。β-甘露聚糖酶ManBl及ManBl（T112R/K291E）在C端加上His標簽后，可能影響了Zn2+與蛋白的結合能力，導致酶活性和酶的熱穩定性降低，因此在克隆表達通過金屬離子穩定N端與C端結構的蛋白時，盡量避免在蛋白的N端或C端添加His標簽。

4 結論

對來源于B. licheniformis KD-1 的β-甘露聚糖酶在T112、L211和K291三個位點分別進行單位點和雙位點突變，獲得了6個突變體，并在枯草芽孢桿菌中進行了分泌表達。ManBl和6個突變體具有相同的最適pH 6.0和最適溫度60℃，所有突變體在pH 6.0-10.0穩定性均高于野生型，較野生型有更高的比活力。6個突變體中，ManBl（T112R/K291E）酶活性最高，為9 742.3 U/mg，是野生型的2.6倍，是熱和堿穩定的β-甘露聚糖酶，能夠適用于多個工業領域。