分枝桿菌轉化甾醇過程的中心代謝關鍵基因轉錄差異分析

熊亮斌 孫吉 劉顯舟 屈占國 計雨情 徐一新 王風清

（1. 上海健康醫學院協同科研中心/藥學院，上海 201318；2. 華東理工大學生物工程學院，上海 200237）

甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，具有抗炎、抗過敏、抗病毒和神經保護［1］等眾多突出功效。目前，市售甾體藥物達400余種，銷售額超1 000億美元，約占全球醫藥總銷售額的10%，我國是甾體原料藥及制劑的主要供應國，產量占世界1/3以上［2］。利用分枝桿菌等微生物代謝轉化低值的植物甾醇（油脂加工廢料、造紙廢料等的回收提取物）［3］，獲得甾體藥物中間體的過程，是現行甾體藥物生產工藝的基礎步驟。通過對分枝桿菌內源甾醇代謝途徑的阻斷，可獲得一系列具有重要價值的甾體藥物中間體轉化菌株，如C19甾體（雄甾-4-烯-3，17-二酮，AD；寶丹酮，BD；9α-羥基化-雄甾 -4-烯 -3，17-二酮，9-OHAD）［4-5］和 C22 甾體（22-羥基 -23，24-去甲膽甾 -1，4-二烯 -3-酮，4-HBC）［6］等。隨后，結合化學及微生物轉化，可獲得包括腎上腺皮質激素、孕激素等幾乎所有種類的臨床用甾體藥物［7］。

分枝桿菌可利用甾醇作為生長及生理代謝唯一的碳和能量來源［8-9］。通常，野生型分枝桿菌可完全降解甾醇，此過程無明顯的中間代謝物積累［8-9］。當阻斷甾醇代謝途徑后，對甾醇底物的不完全降解，將導致9-OHAD等中間代謝物的大量積累。鑒于此類中間產物可能存在的細胞毒性，此時，轉化菌株的呼吸、生長及生理代謝將發生一系列的適應性反應，以應對不利的細胞內外環境［10］。然而，聚焦于分枝桿菌轉化甾醇過程的中心代謝途徑相關研究尚有欠缺，有必要針對性探究此過程的內在調節機制。

前期研究發現，分枝桿菌的SigD因子可能是參與甾醇代謝調節的負調控因子，刪除該基因將引起甾醇途徑關鍵酶基因的轉錄上調，從而在一定程度上增強菌體對甾醇的轉化和目標產物積累［11-12］。此外，甾醇代謝途徑缺陷型的分枝桿菌，在以甾醇為唯一碳源時，無法正常生長；而當同時存在葡萄糖和甾醇時，其細胞生長和代謝甾醇的能力均可迅速恢復，此現象表明分枝桿菌生理代謝調控機制的復雜性。本研究選取可轉化甾醇積累9-OHAD的工程菌株，利用轉錄組測序結合qRT-PCR技術，分析中心代謝相關基因的轉錄水平變化，通過測定在甾醇轉化過程的糖代謝速率變化趨勢，初步揭示分枝桿菌的適應性代謝調節規律，以期為后續工程菌株的升級改造提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質粒及引物 本研究所涉及的菌株及質粒如表1所示。新金分枝桿菌Mycobacterium neoaurum ATCC 25795（Mn）購自美國國家菌種保藏中心。9-OHAD初始生產菌株（MnΔkstD1）均由本實驗室姚抗等［4］構建。用于質粒轉化擴增的大腸桿菌Escherichia coli DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司。本研究用于構建自殺質粒的p2NIL及pGOAL19質粒，為英國傳染病研究所的T. Parish博士惠贈。本研究使用的引物如表2所示。

表1 本研究涉及的菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究涉及的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 培養基 LB培養基：胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物 5 g/L。基本培養基：NH4NO32 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，檸檬酸鐵銨 0.05 g/L，pH 7.5。種子培養基：甘油 20 g/L，檸檬酸 2.0 g/L，NH4NO32.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，檸檬酸鐵銨 0.05 g/L，pH 7.5。發酵培養基：葡萄糖10 g/L，檸檬酸2 g/L，NH4NO32 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，檸檬酸鐵銨0.05 g/L，pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 培養條件 大腸桿菌DH5α接種于5 mL LB培養基，37℃，220 r/min振蕩培養，按需求加入卡那霉素（50 μg/mL）或潮霉素（50 μg/mL）。分枝桿菌的培養：首先，取甘油菌或挑取單克隆，接種于5 mL LB培養基，30℃，220 r/min振蕩培養至OD600= 1.2-1.8；隨后，按1∶10（V/V）接種于30 mL種子培養基，培養至OD600= 1.2-1.8。如需進行表型鑒定，可取種子培養液，按1∶10（V/V）接種于基本培養基，再添加無菌葡萄糖、膽固醇或植物甾醇。如需進行甾醇轉化測定，則取種子培養液，按1∶10（V/V）接種于發酵培養基，同時添加無菌植物甾醇。

1.2.2 kstD1敲除菌株的構建 本菌株由姚抗等［4］構建，大致流程如下：（1）引物設計（表2）。在M.neoaurum ATCC 25795基 因 組（GenBank Accession No. NZ_JMDW00000000.1）查找定位kstD1基因的位 置（GenBank：NZ_JMDW01000019.1 Region：123054…121522，1 533 bp），分別設計上游同源臂引物D-kstD1-UF & D-kstD1-UR，下游同源臂引物D-kstD1-DF & D-kstD1-DR。（2）同源臂擴增。利用高保真PrimerSTAR Max DNA聚合酶（寶生物工程有限公司），以新金分枝桿菌Mn總基因組為模板，進行PCR擴增；隨后，采用PCR產物純化試劑盒回收，獲得上下游同源臂。（3）同源臂及p2NIL質粒酶切。分別利用Hind III & Pst I或Pst I & Kpn I雙內切酶體系，對上下游同源臂純化產物進行酶切；同時，利用Hind III & Kpn I酶切p2NIL質粒提取物。（4）構建p2NIL-同源臂重組質粒。利用T4 DNA連接酶連接p2NIL及上下游同源臂的酶切產物，獲得重組質粒，轉化DH5α感受態，以D-kstD1-UF & D-kstD1-DR驗證獲得陽性克隆。（5）構建pGOAL19-同源臂重組質粒。利用Pac I酶切pGOAL19質粒提取物，凝膠電泳回收分子量較大的酶切條帶（7 949 bp）；同時，利用Pac I酶切p2NIL-同源臂重組質粒提取物，純化回收；隨后，利用T4 DNA連接酶連接，獲得自殺質粒p19-kstD1，轉化DH5α感受態，篩選獲得陽性克隆，即為可用于kstD1基因刪除的自殺質粒。采用電轉化的方式，將自殺質粒轉入分枝桿菌感受態細胞，通過兩步篩選獲得kstD1基因缺失的菌株［13］。

1.2.3 轉化能力評估［11］按1.2.1方法準備種子培養液，轉接發酵培養基，測試kstD1基因缺失菌株轉化甾醇積累9-OHAD的能力。培養條件為30℃，220 r/min，培養時間120 h，每隔24 h取樣500 μL。待取樣完畢，以500 μL乙酸乙酯振蕩萃取，12 000× g，離心10 min。取上層萃取液，可用于薄層色譜法（TLC）分析；展開劑為石油醚∶乙酸乙酯 =6∶4，跑板后風干，以20%稀硫酸噴淋表面，隨后置于105℃烘箱，顯色約6-8 min。高效液相色譜（HPLC）分析：取上層萃取液，置于1.5 mL離心管風干，加入HPLC級甲醇重溶，12 000 × g，離心10 min，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即可用于HPLC分析。HPLC參數如下：色譜柱Agilent XDB-C18（250 mm × 4.6 mm），進樣體積10 μL，流動相為甲醇∶水 = 8∶2，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。

1.2.4 RNA提取、轉錄組測序及qRT-PCR分析［11］分枝桿菌總RNA的提取步驟按FastRNA Pro Blue RNA試劑盒，及FastPrep-24 樣品處理系統（MP Biomedicals，美國）說明書進行。利用FastQuant cDNA試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），對提取的RNA進行反轉錄；采用Quant one step qRTPCR Kit（SYBR Green）（天根生化科技有限公司，北京）進行qRT-PCR分析實驗。菌株發酵轉化條件下培養24 h取樣，收集約含1010個細胞的培養液（OD600= 1.0，細胞濃度約為1 × 109cells/mL，此時取10 mL培養液，細胞數約為1010個；若OD600= 2.0，則需取5 mL培養液，細胞數約為1010個，依此類推），4 000×g，4℃離心15 min，收集菌體。隨后，按試劑盒說明書步驟，進行破菌，提取總RNA，去除cDNA，反轉錄，送上海華大基因科技有限公司測序，或開展qRT-PCR分析。

1.2.5 葡萄糖含量的測定 按葡萄糖含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書要求，稍加調整測定培養液殘留葡萄糖濃度。取培養液1 mL，離心收集上清，按20 μL樣品液，20 μL試劑一、160 μL試劑二和試劑三的混合液（即用即配，1∶1比例混合）配制測定體系；同時，設置陽性對照和陰性對照，此外，利用試劑盒中的葡萄糖標準品配制標準曲線測定孔。隨后，將混合液放入37℃靜置孵育15 min，于505 nm波長讀取吸光度值。

2 結果

2.1 缺失kstD1基因的9-OHAD初始生產菌株構建結果

基于同源重組無標記刪除技術，利用目的基因上游同源臂正向引物D-kstD1-UF和下游同源臂反向引物D-kstD1-DR，進行PCR擴增驗證。結果如圖1-A所示，標記為Mn的泳道則為未發生同源重組的原始菌株PCR擴增結果，而標記為MnΔk1的泳道即為缺失kstD1基因的分枝桿菌菌株PCR擴增結果。隨后，采用發酵轉化評估顯示，所獲得的MnΔk1菌株，具有轉化甾醇積累9-OHAD中間產物的能力（圖 1-B）。

圖1 刪除kstD1基因的分枝桿菌PCR驗證及轉化甾醇結果Fig. 1 Effect of deleting kstD1 on the Mycobacterium PCR verification and biotransformation of sterols

2.2 中心代謝相關基因的轉錄分析

為研究分枝桿菌在代謝甾醇積累甾體藥物中間體時，轉化菌株的糖酵解、磷酸戊糖等中心代謝途徑的響應調節機制。利用上述步驟獲得具有代表性的9-OHAD轉化菌株MnΔk1，在添加1 g/L甾醇底物的條件下培養轉化24 h，分析測定其與野生型菌株的轉錄差異情況。

結果顯示，（1）在野生型菌株添加甾醇時，如采用轉錄上調或下調2倍為閾值（Log2值≥1或≤-1），分別有琥珀酸脫氫酶復合體D亞基的編碼基因sdhD（2.63），琥珀酸脫氫酶復合體C亞基sdhC（2.52），琥珀酰輔酶A合成酶β亞基sucC（1.25）和果糖-1，6-二磷酸酶glpX（1.13）等出現明顯的轉錄上調；另有6-磷酸果糖激酶pfkB（-2.85），烏頭酸酶acn（-1.15），檸檬酸合酶citA（-1.14）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶zwf（-1.12）等出現顯著的轉錄下調（圖2-A）。（2）當MnΔk1菌株轉化甾醇積累9-OHAD產物時，我們注意到琥珀酰輔酶A合成酶α亞基sucD，琥珀酸脫氫酶復合體A亞基sdhA，琥珀酸脫氫酶復合體B亞基sdhB，蘋果酸合酶glcB等基因的轉錄水平出現進一步上調，相對野生型菌株，分別提高2.10、1.48、1.29和1.17（圖2-B）。上述結果表明，缺失kstD1的分枝桿菌菌株在轉化甾醇積累9-OHAD過程中，中心代謝途徑相關基因的轉錄出現規律性轉錄擾動。

圖2 分枝桿菌轉化甾醇過程中心代謝相關基因的轉錄對比分析Fig. 2 Transcriptional comparisons of genes related in central metabolism pathways during the sterol transformation in Mycobacterium

2.3 中心代謝限速步驟關鍵基因轉錄水平的qRTPCR驗證

為確認MnΔk1菌株在轉化甾醇積累甾體藥物中間體的過程中，中心代謝限速步驟關鍵基因的轉錄水平變化趨勢，隨后按發酵轉化條件培養菌體，于24 h取樣提取總RNA，根據16s rRNA序列設計內參引物，分析了中心代謝途徑關鍵基因的轉錄水平變化。

結果如圖3所示，除未定位到的關鍵基因之外，在9-OHAD生產菌株MnΔk1中，糖酵解途徑的6-磷酸果糖激酶pfkB基因（下調1.96倍），丙酮酸激酶pyk基因（下調1.49倍）；磷酸戊糖途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶zwf基因（下調3.57倍），6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶gntZ基因（下調2.43倍）；三羧酸循環的檸檬酸合酶citA基因（下調2.5倍），異檸檬酸脫氫酶icd2基因（下調1.78倍），酮戊二酸脫氫酶kdg基因（下調1.92倍）等限速步驟關鍵基因，均出現了較為明顯的轉錄下調。

圖3 中心代謝關鍵基因轉錄的qRT-PCR分析結果Fig 3 qRT-PCR analysis of key genes in central metabolism

2.4 甾醇轉化過程中葡萄糖代謝速率的變化測定

為評估轉化甾醇過程中分枝桿菌對葡萄糖的代謝情況，我們測定了單位濕重菌體的葡萄糖消耗速率。結果如圖4所示，相對野生型Mn菌株，MnΔk1菌株對葡萄糖的利用速率分別低64.9%（24 h）和19.8%（48 h）。隨著轉化時間的延長，在發酵體系中，葡萄糖消耗殆盡，葡萄糖代謝速率逐漸趨于零。

圖4 分枝桿菌轉化甾醇過程的葡萄糖代謝速率變化Fig. 4 Metabolic rate of glucose during the sterol bioconversion in Mycobacterium

3 討論

分枝桿菌遭遇不良的外環境時，菌體內的眾多調控基因可迅速響應pH、溶氧、離子濃度等壓力脅迫，通過調整自身的營養代謝或表面結構等，以適應外環境的劇烈變化［14-17］。例如，酸性環境可使分枝桿菌生長明顯減緩，而如果對其中的雙組分調控系統PhoP-PhoR進行功能刪除，菌體內部發生代謝重構，又可部分恢復正常的生理代謝功能［18］。分枝桿菌代謝甾醇獲得甾體藥物中間體的反應過程，關鍵限速步驟在于菌體內源代謝途徑對底物的轉化效率。通過強化途徑關鍵酶基因的表達，理論上可改善菌體對底物的轉化［11，19］。然而，由于甾體中間產物可能存在的細胞毒性，大量積累甾體藥物中間體的過程，正是形成負反饋抑制菌體生理代謝的不利因素之一［10］，菌體很可能通過減弱呼吸代謝等一系列適應性調節機制，以降低對外環境物質和能量的交換，然而此類適應性調節機制很可能對底物轉化速率產生負面影響，從而降低了目標產物的積累效率。

本研究集中分析了9-OHAD的轉化菌株MnΔk1，在代謝甾醇積累中間體過程的中心代謝相關基因轉錄差異變化。結果顯示，在菌株轉化甾醇積累9-OHAD中間體的中前期，糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和三羧酸循環限速步驟的關鍵基因，出現普遍的轉錄下調，表明在葡萄糖和甾醇同時存在的轉化階段，MnΔk1菌株對前者的利用很可能受其內在調控機制作用而受到一定程度的抑制。此階段，菌體很可能通過抑制中心代謝途徑的效率，降低細胞的基礎代謝，以減弱甾體藥物相關中間體積累對細胞造成的壓力（圖5）。隨后，通過對葡萄糖消耗速率的測定，在發酵轉化的前期，MnΔk1菌株對葡萄糖的平均消耗速率明顯低于Mn菌株；而在轉化階段的中后期，由于葡萄糖消耗殆盡，菌體對葡萄糖的消耗速率也逐漸趨于接近，說明在復合碳源條件下，分枝桿菌很可能存在一些適應性調控機制，以應對胞外不斷變化的復雜外環境。

圖5 分枝桿菌甾醇代謝與中心代謝途徑的關聯簡圖Fig. 5 Schematic diagram of sterol metabolism pathway and central metabolism pathway in Mycobacterium

4 結論

本研究以新金色分枝桿菌Mycobacterium neoaurum ATCC 25795為研究對象，通過同源重組刪除kstD1基因，獲得可轉化甾醇積累甾體藥物中間體9-OHAD的工程菌株。分枝桿菌在轉化積累目標甾藥中間體時，中心代謝途徑限速步驟的關鍵基因在轉錄水平受到明顯的抑制性調控，揭示了分枝桿菌轉化甾醇過程的適應性調節機制。