牛病毒性腹瀉病毒離子孔道蛋白p7多肽多克隆抗體的制備和鑒定

付強 郭妍婷 陳俊貞 王金泉 史慧君

（新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052）

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是導致牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea，BVD）的病原［1］。牛、羊、鹿等易感動物感染BVDV后，會造成腹瀉、急和慢性黏膜病、病毒血癥、免疫耐受和持續感染、免疫抑制、繁殖障礙等癥狀［2］，是嚴重危害我國養殖業的重要傳染病之一。國際獸疫局（Office International Des Epizooties，OIE）將BVD定為B類傳染病，在我國進出口檢驗檢疫中也將其列為二類傳染病。

BVDV的非結構蛋白p7，位于E2蛋白與NS2蛋白之間，分子量約7 kD，是主要由疏水氨基酸構成的一個小分子肽［3］。由Harada和Carrere-Kremer等人最初提出BVDV和HCV的p7蛋白寡聚并形成離子通道［4］。因為p7的離子通道活性使其被納入在病毒孔蛋白（Viroporin）家族中，Viroporin是一種小的疏水蛋白，當這些蛋白質在宿主細胞膜中寡聚時，它們會形成親水孔，增加膜的通透性，進行離子和小分子運動，破壞細胞的許多生理特性［5-6］。大量研究發現，許多的病毒能表達膜蛋白結構，表現出細胞的離子通道樣的某些功能，以介導病毒進入細胞、幫助病毒復制和調節病毒釋放［7］。目前，針對BVDV p7的研究較少，p7寡聚形成離子孔道的機理尚不明確，抗p7抗體是開展研究工作的必要工具。本試驗通過合成p7蛋白的抗原表位多肽，免疫動物后獲取多克隆抗體，為進一步探索BVDV致病機制提供了有利工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、病毒和動物 MDBK細胞購自上海細胞庫；BVDV毒株NADL為國際標準毒株，購自中國藥品監察所；新西蘭大白兔，體重約2.5-3.0 kg，購自陜西西咸新區灃東新城實驗動物養殖場。本實驗通過新疆農業大學實驗動物福利倫理委員會批準（批準號2020040）。

1.1.2 主要試劑和耗材 弗氏完全/不完全佐劑（F5881）和明膠購自Sigma公司；蛋白標準Marker和透析袋10 kD購自Thermo公司；細胞爬片購自NEST公司；Proclin 300和Casein購自北京索萊寶生物公司；HRP標記山羊抗兔IgG（H+L）（SA00001）和 CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（SA00013）購自武漢三鷹生物技術有限公司；TMB顯色液、BCA蛋白定量試劑盒、考馬斯亮藍染色、Triton X-100、小牛血清白蛋白BSA、山羊血清購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 酶標儀（111-7）、蛋白電泳槽和電源購自Bio-Rad公司；NanodropTMOne（DS-11）購自DeNovi+公司；恒溫振蕩器（B0101123）購自太倉實驗設備廠；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM500）購自德國蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 p7蛋白多肽抗原的設計與合成 使用蛋白二級結構預測平臺JPred（http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4 /index.html）進行BVDV p7蛋白（GenBank登錄號NC_001461.1）的二級結構分析，預測抗原表位，設計多肽并偶聯KLH載體蛋白形成MSQYGAGEIVMMGN-Cys-KLH，交由吉爾生化（上海）有限公司合成，并由該公司完成RP-HPLC檢測多肽純度和質譜分析多肽分子量。

1.2.2 抗血清的制備 首次免疫前，對2只新西蘭大白兔進行耳緣靜脈采血并分離血清，作為陰性對照。取多肽與等體積的弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑進行充分乳化；對2只新西蘭大白兔進行背部皮下多點免疫注射，首免使用弗氏完全佐劑，劑量為400 μg/只，濃度為1 mg/mL；此后使用弗氏不完全佐劑乳化多肽，每兩周進行一次免疫；第5次免疫PBS溶解的多肽，劑量為400 μg/只，濃度為2 mg/mL。免疫完成后對新西蘭大白兔進行心臟采血，收集血清。

1.2.3 抗原親和柱制備 將多肽與溴代預活化的交聯瓊脂糖基質Bromohydrin Purose?4 Fast Flow偶聯。先用10倍體積純水將基質中乙醇洗凈，用篩選通過注射器抽干基質；使用偶聯緩沖液（0.2 mol/L Na2CO3和 0.5 mol/L NaCl，pH 10） 溶 解 多 肽 成 7 mg/mL多肽溶液；將活化的基質與多肽溶液按1∶1混合，25℃反應約20 h；使用Nanodrop測定流出液的濃度并計算偶聯效率，大于95%表明多肽偶聯成功；偶聯結束后，用10倍柱體積的去離子水沖液洗去多肽溶液；添加1 mol/L乙醇胺反應8 h，以封閉未反應的活性基團；反應結束后用去離子水沖洗干凈。

1.2.4 抗原特異性抗體純化 將上述抗原親和基質裝填重力柱，上樣前先用5倍柱體積0.1 mol/L，pH 9.5的Na2HPO4·12H2O沖洗親和柱，進行柱平衡；加入抗血清，每次10 mL，棄去流出液；加入5倍柱體積的0.1 mol/L，pH 9.5 Na2HPO4·12H2O淋洗，棄去淋洗液；加入3倍柱體積的0.2 mol/L，pH 4.0 檸檬酸溶液洗脫抗體，收集洗脫液后立即加入1 mol/L，pH 8.0 Tris緩沖液中和；將洗脫抗體溶液使用PBS溶液透析2 h；0.22 μm濾器過濾后，4℃保存備用。

1.2.5 抗體效價檢測 使用pH 9.6碳酸鹽緩沖液將600 ng/孔多肽包被至96孔酶標板，4℃孵育過夜；每孔加入200 μL封閉液（2%明膠、1‰ Proclin 300、5‰ Casein，PBS配制），37℃孵育2 h；對純化后的抗體進行10倍比梯度稀釋，稀釋比依次從1∶10-1∶1×1012；按照每孔100 μL將稀釋后的抗體加入各孔中，37℃孵育1 h；每孔100 μL加入HRP標記羊抗兔 IgG（H+L）（稀釋度 1∶5 000），37℃孵育 30 min；TMB 顯色液顯色10 min后，使用2 mol/L稀硫酸終止顯色反應，酶標儀測定OD450nm值。檢測孔OD450nm值平均值/陰性對照孔OD450nm平均值 ＞ 2.1則判定為陽性；可檢測到陽性信號的抗體最低稀釋倍數為抗體效價。

1.2.6 抗體純度檢測 使用BCA蛋白定量試劑盒對抗體蛋白定量后，加入5×SDS-PAGE loading buffer混勻，100℃加熱10 min使蛋白變性。使用12%SDS-PAGE電泳分離5和10 μg變性蛋白，100 V電泳約2 h；使用考馬斯亮藍染色30 min，脫色液（30%甲醇、10%冰醋酸，PBS配制）脫色2 h。使用GeL Doc2000成像系統獲得圖像，并使用ImageJ分析p7抗體所占灰度值。

1.2.7 間接免疫熒光檢測多克隆抗體特異性 將MDBK細胞接種至鋪有細胞爬片的24孔細胞培養板中，置于細胞培養箱中繼續培養，待細胞匯合度達60%時，接種1 000 TCID50BVDV感染24 h后，棄掉細胞培養液，使用4%多聚甲醛溶液固定15 min，加入0.5% TritonX-100孵育10 min，加入封閉液（0.5%Triton X-100、3% BSA、1%山羊血清，PBS配制）封閉1 h；加入p7多克隆抗體（稀釋度1∶100），4℃孵育過夜；使用CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（稀釋度1∶250）室溫孵育1 h，使用抗熒光淬滅封片液封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光陽性情況及定位。

2 結果

2.1 p7蛋白多肽抗原的設計

為合成p7蛋白的多肽抗原，使用JPred預測p7蛋白抗原表位，結果如圖1所示，BVDV p7蛋白共由71個氨基酸所組成，其中綠色為β片層結構，紅色為α螺旋結構，其中B表示氨基酸疏水情況；在25% cut-off溶劑可及性時，p7蛋白的親水區域主要位于該蛋白的氨基端，設計MSQYGAGEIVMMGN多肽，并偶聯KLH載體蛋白以刺激輔助T細胞，進而誘導B細胞免疫反應，合成MSQYGA GEIVMMGNCys-KLH多肽。

圖1 P7蛋白二級結構預測Fig. 1 Prediction of secondary structure of P7 protein

2.2 多肽純度和分子量檢測

使用RP-HPLC檢測多肽的純度，同時使用質譜分析多肽的分子量。結果如圖2和3所示，合成多肽的保留時間為9.810 min，峰面積1 197 903（mAU*s），多肽的純度為 80.19%（1 197 903/1 493 847），合成的多肽分子量為794.2 Da。

圖2 RP-HPLC檢測多肽純度Fig. 2 Determination of polypeptide purity by RP-HPLC

2.3 p7多肽抗體效價檢測

圖3 質譜鑒定多肽分子量Fig. 3 Identification of molecular weight of polypeptide by mass spectrometry

第5次免疫后10 d，心臟采血并收集血清，使用多肽偶聯的抗原純化柱進行親和純化。間接ELISA檢測純化后、PBS對照組和免疫前的抗體反應性。結果如表1所示，經過親和純化后的抗體效價達1∶100 000（PBS對照組的陰性參考值為OD450nm=0.110），與抗原有顯著的反應性，滿足后續實驗需求。

表1 間接ELISA檢測抗體效價Table 1 Detection of antibody titer using indirect ELISA

2.4 SDS-PAGE檢測抗體純化結果

多抗血清通過多肽偶聯的抗原純化柱親和純化后，使用10 kD半透膜對純化血清進行透析，并使用0.22 μm濾器過濾除雜質。SDS-PAGE電泳后使用考馬斯亮藍染色鑒定抗體純度。結果如圖4所示，在55 kD處可見抗體重鏈分子，在25 kD處可見輕鏈分子，使用ImageJ分析p7抗體所占灰度值比為90.2%。表明已純化出兔抗p7多肽IgG抗體。

圖4 SDS-PAGE 檢測抗體純化結果Fig. 4 SDS-PAGE results of antibody purification

2.5 免疫熒光染色鑒定p7多肽多克隆抗體

為進一步鑒定多克隆抗體的反應性，使用免疫熒光染色鑒定BVDV感染MDBK細胞p7蛋白表達及分布情況。結果如圖5所示，BVDV感染MDBK細胞后表達的p7蛋白能與p7多克隆抗體發生特異性反應，可見紅色熒光廣泛分布于BVDV感染MDBK細胞的細胞膜周圍，與p7寡聚在細胞膜上形成離子孔道的蛋白分布一致，而對照組細胞則無法檢測到紅色熒光，表明p7多肽多克隆抗體具有較好的反應性和特異性。黑色箭頭指示細胞核。

圖5 免疫熒光染色測定p7多肽多克隆抗體的反應性Fig. 5 Determination of the reactivity of p7 polypeptide polyclonal antibody by immunofluorescence staining

3 討論

病毒進入宿主后，病毒孔蛋白與宿主細胞中的不同細胞器膜相互作用，借助宿主細胞某些因子組裝成離子通道，介導一些離子（Na+、Ca2+、K＋、H＋等）運輸而對病毒進入細胞及子代病毒在細胞中成熟產生影響［8-9］。新型丙型肝炎病毒p7離子通道抑制劑BIT225可抑制脂質膜中的p7離子通道活性，并在BVDV感染試驗中具有抗病毒活性，BIT225與重組干擾素α-2b的組合顯示出針對BVDV的協同抗病毒作用，并且通過添加利巴韋林進一步增強了協同作用［10］。用長烷基鏈亞氨基糖衍生物處理人工脂質膜中的p7，對p7的離子通道活性的抑制作用隨著濃度的升高而增強。而這類化合物對BVDV具有強大的抗病毒活性［11-12］。這表明病毒傳播過程中離子通道活性的重要性，以及p7有可能是潛在的藥物靶點。而目前關于p7如何形成離子孔道幫助BVDV釋放？p7蛋白翻譯后如何轉運？需要哪些輔助蛋白的修飾和協作？這些問題的解決都需要構建p7蛋白抗體，否則難以檢測其定位和表達，并探明其形成離子孔道的機制。在本研究中，使用p7蛋白的N端氨基酸，合成多肽，經多次免疫家兔后使用ELISA和免疫熒光染色檢測多肽多克隆抗體具有較好的反應性和特異性。

使用生物信息學平臺分析p7蛋白，發現N端1-14位氨基酸具有較好的親水性。使用化學方法合成多肽并偶聯KLH，免疫新西蘭大白兔制備抗p7多抗血清。ELISA測定經抗原純化柱親和純化后的抗體效價，結果顯示抗血清效價在1∶100 000，說明制備的p7多肽抗體具有較好的反應性。Western blot檢測抗p7多肽抗體結果顯示在55 kD和25 kD處有較為明顯的條帶。免疫熒光染色BVDV感染MDBK細胞可見細胞膜上出現與p7多克隆抗體發生特異性反應，而p7蛋白主要形成離子孔道存在于細胞膜上，綜上結果表明本研究獲得的多肽多克隆抗體可作為抗BVDV p7檢測方法中的具有特異性結合作用的抗體，也為后期深入研究BVDV p7的功能及作用機制奠定了基礎。

4 結論

成功制備兔抗BVDV p7多肽多克隆抗體，使用ELISA和免疫熒光染色發現該抗體具有較好的反應性和特異性，為進一步研究p7形成離子孔道的機理提供了有利工具。