煙臺黑豬SLA-2基因真核表達載體的構建及表達

胡曉 王寶寶 竇少華 姜南 付常振 金行 高鳳山

（大連大學生命科學與技術學院，大連 116622）

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）是染色體上由高度多態、緊密連鎖的基因座組成的一個遺傳區域，編碼一系列與免疫應答相關的分子。豬的MHC也叫豬白細胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）。SLA由 3個 基因簇組成，分別是SLA I、II、III。其中SLA I類分子主要介導細胞免疫應答。該分子包括重鏈和輕鏈［1］，輕鏈只有一個等位基因β2微球蛋白（β2 microglobulin，β2m）；重鏈具有多態性，包括胞內區、跨膜區、胞外區和信號肽4個區域，含有SLA-1、SLA-2和SLA-3三個功能基因［2-3］。其中，SLA-2比SLA-1和SLA-3在信號肽的起始端多3個氨基酸。重鏈與輕鏈以非共價鍵結合構成SLA I類分子，不僅識別內源性抗原肽［4］，也可以通過交叉遞呈途徑識別外源性抗原肽［5］。被識別的多肽與SLA I類分子形成抗原肽-MHC分子復合物（peptide-MHC complex，pMHC）并被遞呈到細胞表面，pMHC進一步與CD8+T淋巴細胞表面的T細胞受體（T cell receptor，TCR）結合，激活CD8+T淋巴細胞，使活化的CD8+T淋巴細胞轉化為有細胞毒性的T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），發揮毒性作用并對靶細胞造成殺傷，啟動機體的細胞免疫應答［6］。不同的SLA I類分子遞呈的抗原肽不同，根據抗原遞呈機理，可建立不同SLA I類分子表位遞呈規律的研究平臺。

煙臺黑豬是我國優良的地方豬種之一，基因資源十分寶貴［7-8］。本課題組已經克隆了煙臺黑豬SLA-2基因，并構建了該基因的原核表達載體，進行了原核表達研究［9］。然而，煙臺黑豬SLA-2基因的真核表達研究尚未開展，其表位遞呈規律研究平臺也尚未建立。本研究擬以煙臺黑豬SLA-2-YT/pMD 18-T全基因為材料，構建SLA-2-YT編碼區基因的真核表達載體，并使其在sT2細胞系中優勢表達，為探究煙臺黑豬SLA-2-YT基因的抗原表位遞呈規律等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和細胞 煙臺黑豬SLA-2-YT/pMD18-T菌種、psPAX2菌種、pMD2.G菌種由本實驗室保存；pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（簡稱pCDH）真核表達載體菌種購自中國上海思享生物科技有限公司；pMD 19-T Simple Vector和Escherichia coli.Top10菌種購自寶生物工程（大連）有限公司；Stbl 3感受態細胞購自北京全式金生物科技有限公司；人胚胎腎上皮細胞（HEK-293T）由大連醫科大學李文哲教授課題組惠贈；豬腎上皮細胞（PK15）購自中國獸醫藥品監察所中國獸醫微生物菌種保藏管理中心并由本實驗室保存；sT2細胞由本實驗室在前期工作中利用CRISPR/Cas9技術將PK15細胞的Tap轉運蛋白基因（TAP1、TAP2）敲除后獲得并保存。

1.1.2 主要試劑 質粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒及配制LB培養基的試劑均購自上海生工生物工程有限公司；高保真DNA聚合酶、核酸染料、Lipoectine2000脂質體轉染試劑購自諾唯贊有限公司 ；T4 DNA Ligase、DL 2000 DNA Marker、dNTP、限制性內切酶（EcoR I、Hind III、Xba I、Not I）購自寶生物工程（大連）有限公司；無內毒素質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清購自BI公司；DMEM高糖培養基和Opti-MEM培養基購自 Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自寶生物（大連）有限公司；Western Blotting使用的0.45 μmPVDF膜購自Millipore公司；小鼠SLA-1-HB01單克隆抗體由本實驗室自制；GAPDH Mouse Monoclonal antibody（ 貨 號 ：60004-1-Ig） 購自Proteintech公司；Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（貨號：D110087）購自上海生工生物工程有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒購自新賽美生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 梯度PCR儀購自基因有限公司；各型電泳儀和紫外分析儀購自北京市六一儀器廠；二級生物安全柜和二氧化碳培養箱購自ESCO公司；超靈敏多功能凝膠成像儀購自通用電氣公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank數據庫中煙臺黑豬SLA-2-YT編碼區（coding sequence，CDS）基因序列（GenBank序列號：AB672508.1），遵守引物設計原則，使用Vector NTI 11.5和Oligo 7軟件，設計1對擴增煙臺黑豬SLA-2基因編碼區序列的特異性正、反向寡核苷酸引物（上下游引物），根據pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro載體的序列和結構特點，選擇的限制性內切酶為：Xba I和 Not I，在上下游引物的5′端分別添加酶切位點和保護性堿基，引物信息見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of the primers used in PCR

1.2.2 目的基因PCR擴增與DNA片段回收 以SLA-2-YT/pMD18-T質粒為模板，以pSLA-2-YTF/pSLA-2-YT-R 作 引 物， 用 Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶系統進行PCR，擴增SLA-2-YT編碼區基因序列，PCR反應體系為：5×SF buffer（with 10 mmol/L MgSO4），5 μL ；dNTP Mix（10 mmol/L each），1 μL；SLA-2-YT/pMD 18-T 全 基 因質粒（提取后稀釋30倍），4 μL；SLA-2-YT-F（25 μmol/L），1 μL ；SLA-2-YT-R（25 μmol/L），1 μL ；Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μL），0.5 μL；超純水補足至25 μL；PCR擴增程序為：95℃，預變性3 min；95℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀成像。確認目的條帶大小正確后，用DNA 凝膠回收試劑盒進行膠回收。由于用DNA聚合酶Phanta?Super-Fidelity DNA Polymerase進行PCR擴增的目的片段末端平滑化不易與pMD 19-T Simple Vector連接，因此需要在回收后的PCR產物DNA雙鏈的3′端分別添加Poly A尾（堿基“A”），使其轉變為黏性末端，反應液體系如下：10×Ex Taq buffer，5 μL ；dATP（10 mmol/L），1 μL ；PCR 回 收產物，35 μL ；Ex Taq 酶（5 U/μL），1 μL，超純水補足至50 μL；條件為：72℃水浴15 min。添加Poly A尾后的PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統成像，目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒進行膠回收并保存回收產物。

1.2.3 SLA-2-YT編碼區基因TA克隆載體的構建 將回收的目的條帶與pMD19-T Simple Vector連接，反應體系為：pMD 19-T Simple Vector，0.5 μL；加Poly A尾回收產物，9.5 μL；Solution I，10 μL；條件為：16℃低溫水浴2 h。將連接產物轉化至Escherichia coli. Top10感受態細胞，涂平板，37℃過夜培養，挑取生長良好的重組單克隆菌落擴大培養后進行質粒提取，將提取的重組質粒用Not I/Xba I進行雙酶切驗證，選擇初步鑒定正確的陽性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司測序。通過雙向DNA測序確認插入序列的完整性后，將測序正確的陽性克隆菌株命名為 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple，并保存菌種供后期實驗使用。

1.2.4 SLA-2-YT編碼區基因真核表達載體的構建 從超低溫冰箱取出SLA-2-YT/pMD 19-T Simple和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro菌種，經平板劃線、挑取單菌落培養過后，用DNA質粒小提中量試劑盒提取質粒，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。對SLA-2-YT/pMD 19-T Simple質粒進行Not I/Xba I雙酶切處理，回收目的條帶；對真核表達載體pCDH-CMV-MCSEF1-Puro質粒（環狀）同樣進行Not I/Xba I雙酶切處理，使載體線性化，并回收載體條帶。將目的條帶與載體條帶用T4 DNA連接酶連接，反應體系為：目的條帶 15 μL（μg）；載體條帶 0.5 μL（μg）；超純水1.5 μL；條件為：45℃水浴5 min，立即冰浴2 min，然后向反應液中加入10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL ；T4 DNA Ligase 1 μL ；混勻后在 16℃低溫水浴鍋中過夜放置。連接產物轉化至Stbl 3感受態細胞中，涂布在含有氨芐青霉素（AMP+）的LB平板上，37℃過夜培養；然后挑取單菌落至AMP+LB液體培養基中，37℃振蕩培養12 h；培養的菌液提取質粒后利用雙酶切鑒定真核重組DNA載體中是否攜帶插入片段；將初步鑒定正確的陽性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司測序，使用Vector NTI 11.5對DNA測序結果進行序列分析驗證插入核苷酸序列的正確性。將測序正確的陽性重組菌株命名為SLA-2-YT/pCDH，重組質粒SLA-2-YT/pCDH圖譜見圖1。

圖1 SLA-2-YT/pCDH 重組表達質粒示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the recombinant expression plasmid SLA-2-YT/pCDH

1.2.5 嘌呤霉素終濃度測定 復蘇的sT2細胞傳代兩次待細胞狀態穩定后，以每孔4×105個細胞鋪24孔板，共鋪33個孔，37℃ CO2培養箱中培養至細胞融合率達到70%-80%時，每孔添加終濃度為0、5、10、15、30、60、90、200、300、500、1 000 μg/mL的嘌呤霉素，并將培養基補足至2 mL，每個濃度設置3個重復，每2 d使用含有對應濃度的嘌呤霉素的培養基對細胞進行換液，7 d后可以殺死所有細胞的最低濃度即為篩選轉染外源基因的sT2細胞的最佳嘌呤霉素終濃度。

1.2.6 慢病毒包裝 將凍存的HEK-293T細胞復蘇，傳代兩次待細胞狀態穩定后進行慢病毒包裝前的細胞鋪板，每個60 mm培養皿接種1.5×106個細胞，待培養皿中的HEK-293T細胞融合率達到80%-90%后，按照Lipoectine2000脂質體轉染試劑的說明書將pCDH-CMV-MCS-EF1-Pruo質粒和SLA-2-YT/pCDH重組質粒分別轉染到HEK-293T細胞中，置37℃CO2培養箱中培養6 h，去除培養皿中含轉染試劑的培養基，更換為4 mL新鮮的DMEM培養基，分別于更換培養基后48 h、72 h收集培養皿中的上清液，經3 000 r/min離心10 min、0.22 μm PVDF膜濾器過濾，根據文獻測定并計算病毒滴度［10］，將剩余的病毒液凍存于超低溫冰箱中，備用。

1.2.7 慢病毒感染sT2細胞及抗性篩選 根據文獻及最佳感染復數（multiple of infection，MOI）值計算公式：MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒體積（mL）/細胞個數，設定MOI值梯度為2.5、5、10、20、40、60，分別進行病毒感染預實驗，確定感染sT2細胞的最佳MOI值范圍［11］。將凍存的sT2細胞復蘇，傳代2次后進行慢病毒感染前的細胞鋪板，狀態良好的細胞以每孔1.5×105個細胞接種于6孔板中，37℃ CO2培養箱中培養12 h至細胞完全貼壁，從超低溫冰箱取出1.2.6中收集的病毒液于4℃解凍備用，參考最佳MOI值，將1.5 mL病毒液與0.5 mL DMEM培養基混勻后加入需感染的孔板中，同時在其中一個孔板中只加入2 mL DMEM培養基，作為對照組，37℃ CO2培養箱中培養；病毒感染24 h后去除含病毒的培養基，更換為新鮮的DMEM培養基，繼續在37℃ CO2培養箱中培養；換液6-8 h后，加入終濃度為30 μg/mL的嘌呤霉素進行篩選，待6孔板中細胞長滿后傳代至100 mm細胞培養皿中繼續培養至細胞長滿，一部分細胞進行Western Blotting驗證，另一部分細胞添加嘌呤霉素繼續篩選，直到獲得成功轉染外源基因的單克隆細胞，擴大培養并命名為pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2，將部分細胞凍存于液氮罐中，備用。

1.2.8 Western Blotting檢測外源基因的表達 復蘇PK15、sT2兩個細胞株，傳代兩次待細胞狀態穩定，使用RIPA細胞裂解液分別提取PK15、sT2和1.2.7中篩選得到的pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，然后將蛋白原液、超純水和5×蛋白上樣緩沖液按比例混勻后煮沸5-10 min，制成終濃度為30 μg/μL的蛋白溶液樣品，分別取10 μL樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后參考預染Marker進行切膠并將蛋白轉印到PVDF膜上，轉膜結束后，使用1×麗春紅染液染色，確認轉膜成功后參考預染Marker切割目的條帶和內參GAPDH條帶，用5%BSA溶液在室溫下封閉1 h，除去封閉液后，含目的條帶的膜中加入稀釋的小鼠抗SLA-1-HB01單克隆抗體（視抗體推薦倍數稀釋），含GAPDH條帶的膜加入稀釋的小鼠抗GAPDH 單克隆抗體，室溫孵育1 h，再4℃孵育過夜，去除抗體溶液，用1×TBST溶液洗膜4次，每次5 min，徹底洗去未與蛋白結合的一抗，分別加入稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h，然后用1×TBST洗膜4次，每次5 min，最后采用超敏ECL化學發光試劑盒進行顯色，通過GE AI600多功能超靈敏成像儀進行顯影成像，以檢測sT2細胞中SLA-2-YT的表達量。

1.2.9 統計學處理 采用Image J 軟件分析Western Blotting雜交條帶的累積光密度值（IOD），計算目的蛋白的相對光密度值（目的條帶的IOD值與內參GAPDH的IOD值之比），然后采用GraphPad Prism 8.0.1軟件對數據進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 煙臺黑豬SLA-2-YT CDS區基因PCR擴增及加尾

對煙臺黑豬SLA-2-YT基因編碼區進行PCR擴增，結果顯示擴增的目的基因條帶大小約為1 100 bp（圖2-A），與理論設計值1 104 bp相符，表明目的基因被成功擴增。PCR回收產物加Poly A尾并回收，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示在同樣條件下加尾回收產物略大于PCR回收產物（圖2-B），初步判斷加Poly A尾成功，可以用于下一步實驗。

圖2 煙臺黑豬SLA-2-YT基因CDS區PCR擴增與加尾Fig. 2 PCR amplification and tailing of SLA-2-YT gene CDS region in Yantai black pig

2.2 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple克隆表達載體鑒定

2.2.1 重組質粒SLA-2-YT/pMD 19-T Simple限制性雙酶切鑒定 利用Xba I、Not I限制性內切酶對SLA-2-YT/pMD 19-T Simple質粒進行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據結果（圖3）可以看出：每個樣品的泳道上均有兩個條帶，靠近點樣孔端的條帶為載體帶，大小約為2 692 bp，離點樣孔較遠的條帶為目的條帶，大小約為1 100 bp，1-7號樣品的載體條帶大小正確，即1-7號樣品可能為成功構建的克隆質粒，將對應的3個菌株送去生物公司測序，測序結果經分析后顯示1、2號菌株的序列正確，即1、2號為成功構建的重組克隆菌株。

2.2.2 序列分析 SLA-2-YT/pMD 19-T Simple經核酸序列測序后，進一步用Vector NTI 11.5進行序列比對，結果（圖4）顯示SLA-2-YT/pMD 19-T Simple重組克隆載體中插入的SLA-2-YT編碼區基因序列與原序列100%同源，未出現核苷酸突變。

圖4 Vector NTI 11.5分析SLA-2-YT/pMD 19-T Simple重組克隆載體中插入序列Fig. 4 Insertion sequences in SLA-2-YT/pMD 19-T Simple recombinant vector analyzed by Vector NTI 11.5

2.3 SLA-2-YT/pCDH真核表達載體鑒定

2.3.1 重組質粒SLA-2-YT/pCDH限制性雙酶切鑒定 真核表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro質粒首先經限制性內切酶Xba I、Not I雙酶切后進行膠回收，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結果（圖5）顯示回收的條帶大小約為7 300 bp，與理論值7 384 bp相符，表明載體回收成功。SLA-2-YT/pMD 19-T Simple質粒經雙酶切并回收目的基因后，與真核表達載體在T4 DNA Ligase的作用下連接，導入Stbl 3感受態細胞經轉化、挑取單菌落擴大培養后，再次進行雙酶切鑒定，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖6）顯示：每個樣品的泳道上均有兩個條帶，靠近點樣孔端的條帶為載體帶，大小約為7 384 bp，離點樣孔較遠的條帶為目的條帶，大小約為1 100 bp，1-3號樣品的載體條帶和目的條帶的大小正確。

圖5 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 載體回收Fig. 5 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro vector recovery

圖6 重組質粒SLA-2-YT/pCDH雙酶切鑒定Fig. 6 Identification of recombinant plasmid SLA-2-YT/pCDH by double digestion

2.3.2 序列分析 為進一步確定目的基因與真核表達載體連接成功與否，將圖6對應的3個菌株送去生物公司測序，測序結果經初步分析后顯示2、3號菌株的序列正確，表明基因插入成功，即2、3號為成功構建的重組真核表達菌株。進一步經Vector NTI 11.5進行序列比對，證實SLA-2-YT/pCDH重組真核表達載體中插入的SLA-2-YT編碼區基因序列與原序列的同源性仍為100%，沒有出現核苷酸突變，能夠正確編碼對應的蛋白。

2.4 嘌呤霉素最佳濃度篩選

通過不同濃度的嘌呤霉素作用于未轉染的sT2細胞，168 h后對存活細胞使用血球計數板計數。結果（圖7）顯示：不加嘌呤霉素的孔板內的細胞正常增殖，由于孔板底面積有限，細胞增殖數目受到限制；而添加了嘌呤霉素的孔板中的細胞增殖在不同程度上被抑制。由于嘌呤霉素的濃度不斷增大，各孔板中的細胞出現了不同程度的死亡現象：當嘌呤霉素的濃度達到500 μg/mL對應孔板中細胞無存活，根據慣例，選擇最低致死濃度的前一個濃度300 μg/mL進行篩選。因此，選擇300 μg/mL作為嘌呤霉素最佳篩選濃度。

圖7 嘌呤霉素作用于sT2細胞的致死濃度曲線Fig. 7 Lethal concentration curve of puromycin on sT2 cells

2.5 HEK-293T細胞慢病毒包裝及感染sT2細胞

將攜帶SLA-2-YT的質粒和兩種包裝質粒共同轉染HEK-293T細胞后，成功包裝出慢病毒質粒。通過不同濃度的病毒液感染HEK-293T細胞，測得病毒滴度約為1×105TU/mL，通過設定MOI值梯度，用1.2.6中獲得的慢病毒進行感染，通過顯微鏡每天多次觀察細胞狀態，確定慢病毒的最佳感染sT2細胞復數為20。另外，本研究涉及的豬腎上皮細胞（PK15細胞）、用于慢病毒感染的sT2細胞（TAP基因敲除的PK15細胞），導入空載體pCDHCMV-MCS-EF1-Puro質粒的sT2細胞，導入SLA-2-YT/pCDH重組質粒的sT2細胞在光學顯微鏡下的形態如圖8所示，可見這些細胞生長狀態良好、相互之間的外觀形態無明顯區別。

圖8 光學顯微鏡下觀察慢病毒感染后的細胞狀態Fig. 8 Observation of cell state after lentivirus infection under light microscope

2.6 Western Blotting檢測SLA-2-YT/pCDH表達

以PK15細胞系為陽性對照，轉染空載體pCDH的sT2細胞為陰性對照，未轉染SLA-2-YT/pCDH質粒的sT2細胞系為空白對照，通過Western Blotting實驗檢測SLA-2-YT/pCDH的表達情況。結果（圖9）表明，篩選出的4株細胞，與sT2、pCDH/sT2相比較，3號細胞株的SLA-2-YT基因得到了高豐度表達，大小約為45 kD，與理論值相符。用Image J軟件分析累積光密度值后計算目的蛋白的相對表達量，用GraphPad Prism 8.0.1作圖并通過計算得出SLA-2-YT-pCDH/sT2 3號細胞株與sT2細胞、pCDH/sT2細胞相比較，SLA-2-YT呈優勢表達，且相對表達量之間差異極顯著（P＜0.01）。表明插入載體的SLA-2-YT已在sT2細胞中成功表達，且表達量較高。

圖9 Western Blotting 檢測 SLA-2-YT/pCDH 在 sT2 細胞中的表達Fig. 9 Western Blotting to detect the expression of SLA-2-YT/pCDH in sT2 cells

3 討論

本研究在構建真核表達載體時選擇的pCDHCMV-MCS-EF1-Puro載體是慢病毒載體系統，其載體序列上有多個限制性內切酶位點，可在PCR引物上添加酶切位點利于目的基因與真核表達載體連接；它具有氨芐青霉素抗性，篩選標記為嘌呤霉素，便于前期單克隆菌株的擴大培養和質粒轉染后的細胞篩選［12］；本研究將Stbl 3菌株作為真核表達載體的宿主菌，它是慢病毒載體系統優良的宿主菌株，其基因組中含有重組酶recA13突變，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率［13］。本研究用于轉染的細胞是實驗室前期利用基因編輯技術將PK15細胞的TAP轉運蛋白基因（TAP1、TAP2）敲除后得到的sT2細胞，該細胞中需TAP轉運蛋白參與遞呈內源性抗原的胞質途徑被阻斷，因此只能遞呈外源性的抗原肽，從而可以通過有目的設計外源性抗原肽篩選細胞遞呈的SLA I限制性的抗原表位。但研究中發現，將TAP1和TAP2基因敲除后，PK15細胞本身表達的SLA I類分子急劇減少，甚至不表達，從而為引入外源SLA I分子在sT2表達創造了條件，從而可以建立表達特定SLA I類分子的sT2細胞系，將來可以篩選特定SLA I類分子限制性的CTL表位。在開展本實驗時，慢病毒包裝并感染sT2細胞后的嘌呤霉素篩選過程并不順利，由于初次篩選時選擇的嘌呤霉素濃度不合理，SLA-2-YT在sT2細胞內的表達量不夠高。在設置合理的嘌呤霉素濃度梯度對sT2的嘌呤霉素最佳篩選濃度進行確定后，選擇能夠殺死大部分sT2細胞的濃度（300 μg/mL），最終得到了優勢達外源SLA-2-YT基因的sT2細胞。

煙臺黑豬是我國地方特色品種，研究我國地方品系豬SLA I類分子基因的表達及相關功能更具有戰略意義［9，14］。本研究不僅成功構建了煙臺黑豬SLA-2-YT基因的真核表達載體，并且實現了在 sT2細胞的優勢表達，從而建立了煙臺黑豬SLA-2-YT基因在sT2細胞中的抗原遞呈研究體系。課題組在后續研究中將進行SLA-2-YT限制性的CTL多肽表位篩選，并進行相關功能研究。

4 結論

本實驗成功構建了SLA-2-YT/pCDH重組真核表達載體，并成功轉染至sT2細胞，使其在sT2細胞中優勢表達，為研究外源SLA-2-YT在sT2細胞中的抗原遞呈規律及CTL多肽表位篩選奠定了基礎。