成纖維細胞生長因子20單克隆抗體的制備及鑒定

唐祿 董麗平 尹茉莉 劉磊 董媛 王會巖

（1. 吉林醫藥學院，吉林 132013；2. 吉林省抗體工程科技協同創新中心，吉林 132013）

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）是一類能促進成纖維細胞生長的蛋白質，目前為止已經發現的FGF家族共有23個成員［1］，分子量為17 kD-34 kD，成員之間的氨基酸序列同源性較高，多數成員來自中胚層和神經外胚層細胞［2］。廣泛存在于人和動物體內，參與多種器官發育、血管新生、促有絲分裂、細胞遷移和分化等，現已廣泛應用于組織創傷修復，美容創面修復、皮膚早衰等領域［3］。FGF20是FGF家族中的一員，與FGF9和FGF16屬于同一亞家族［4］。2000年首次被Ohmachi等［5］發現，同年 Kirikoshi等［6］在人體中發現了FGF20，其成熟蛋白質由211個氨基酸組成，二級結構存在大量的β折疊。成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth gactor recepter，FGFR）屬于酪氨酸激酶受體的一種［7-8］，FGF20通過與FGFR特異結合，啟動相應的信號轉導，從而發揮其生物學功能。FGF20在退行性神經系統疾病［9］、形態發生［10］、毛囊生長［11-12］、組織修復［13］等過程中發揮著重要作用。另外，FGF20的多態性還是中國漢族人群的PD 疾病的危險因素［14］。Jeffers等［15］利用實時定量PCR技術檢測不同人腫瘤細胞中FGF20 mRNA表達情況，發現在肺癌、胃癌及結腸癌細胞中FGF20基因表達量最高，在正常組織中則是低表達；劉萍等［16-17］利用免疫組化檢測結果顯示，FGF20在大腸癌組織中異常表達，隨后通過免疫組化和Western Blot檢測，顯示直腸癌中FGF20表達顯著高于正常腸粘膜組織，且FGF20表達與結直腸癌組織的浸潤及淋巴結轉移顯著相關。有研究發現，FGF20基因定位的8號染色體區域，發生突變后容易產生神經退行性疾病，胃癌和肺癌等疾病［18-19］。Fitzmaurice等［20］調查發現，2018年，全球共有2 450萬癌癥病例，導致了960萬人死亡。我國2014年確診的惡性腫瘤病例數為380.4萬例，2019年約為392.2萬例，增長率為3.2%。而肺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、乳腺癌為最為常見的癌癥，如果患者能在患病的早期就及時發現顯得尤為重要。由于FGF20可在肺癌、胃癌及結腸癌細胞中過表達，可作為幾種癌癥潛在的腫瘤標志物，因此制備抗FGF20的高親和力抗體，可以為肺癌和其他癌癥早期診斷篩查及預后評估提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠骨髓瘤細胞株（SP2/0）為本實驗室保存。大腸桿菌BL21（DE3）plysS購于北京全式金生物，載體由上海杰瑞生物工程公司合成構建。Balb/c小鼠購于長春生物制品研究所。

蛋白胨、酵母提取物購于英國OXOID公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗體購于美國Abmart公司；商品化FGF20購于上海優寧維；亞型抗體檢測試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT購于美國sigma公司；胎牛血清購于美國BI公司；RPMI 1640培養基購于美國Gibco公司；SUMO酶（本實驗室保存）；超濾管購于Millipore公司；25 cm2細胞培養瓶、75 cm2細胞培養瓶、96孔培養板和24孔培養板購于美國Corning公司；純化填料和層析柱購于美國GE公司；Tris堿、NaCl等試劑均為國產。

1.2 方法

1.2.1 pET24a-SUMO-hFGF20表達載體的構建 根據GenBank數據庫FGF20基因（ID：26281）序列的5′端添加SUMO基因序列，并在序列兩側設計Nde I、BamH I酶切位點，優化并合成基因序列。公司合成載體（由上海杰瑞完成）。重組質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3）plysS感受態細胞中。涂布于含Kana+的LB平皿，37℃倒置培養12-16 h。

1.2.2 抗原的表達 從平皿中挑取單菌落，接種于 5 mL LB 培 養 基 中（Kana+，10 μg/mL），37℃、180 r/min振蕩培養至A600達到0.8-1.0左右時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導目的蛋白表達，20℃、180 r/min振蕩培養16 h，4℃、9 000 r/min離心15 min收集菌體。按照菌體∶裂解液（20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA-2Na pH 8.2）1∶10的比例，重懸菌體超聲破碎，功率為50%，工作4 s，間休6 s，超聲30 min。離心收集上清和沉淀。SDS-PAGE分析蛋白表達情況。

1.2.3 抗原的純化 大量制備菌體，加入裂解液溶解后，在低溫條件下用高壓均質機破碎菌體。4℃、20 000 r/min，離心 30 min，收集上清，0.45 μm濾膜過濾，上清液先用鎳NTA親和層析柱純化，收集洗脫液，PBS溶液透析過夜，然后采用SUMO酶進行酶切。4℃條件下酶切16 h。酶切后樣品再次經鎳NTA親和層析柱純化，收集流出液，用超濾管（截流分子量10 kD）超濾置換溶液。收集的蛋白溶液純度采用SDS-PAGE法檢測，濃度用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定。

1.2.4 動物免疫 選擇7-8周齡雌性Balb/c小鼠3只（20±2）g，將FGF20蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合乳化，通過頸背部多點皮下注射進行首次免疫（100 μg/只小鼠）。兩周后進行第2次免疫，FGF20蛋白與弗氏不完全佐劑（劑量與首次相同）乳化后頸背部多點注射。3次免疫后，小鼠尾靜脈收集血清，用間接ELISA檢測血清中抗體效價。選取一只最佳免疫的小鼠，融合前3 d腹腔注射抗原作加強免疫（劑量同前）。本實驗已通過吉林醫藥學院動物倫理委員會審查（編號：2021-LW004）。

1.2.5 雜交瘤細胞的建立與篩選 首先制備飼養層細胞，取1只未免疫的Balb/c小鼠，處死后置于75%乙醇溶液中浸泡5 min，在超凈工作臺內操作暴露腹膜。用預熱RPMI-1640培養液沖洗腹腔并收集沖洗液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液重懸細胞，細胞計數，將濃度調至1×105個/mL，每孔100 μL，37℃，5% CO2培養箱中過夜。取對數生長期SP2/0細胞，離心重懸后細胞計數。另取血清效價最高的BALB/c小鼠，脫頸處死后75%乙醇浸泡5 min，取脾臟研磨，200目濾網過濾，收集脾細胞。脾細胞和SP2/0細胞以2∶1的比例混合，離心棄上清，滴入50%的PEG溶液 1 mL，靜置45 s后，加入RPMI-1640細胞培養液終止PEG作用。用含10%胎牛血清和HAT的RPMI-1640細胞選擇培養液重懸，96孔板中每孔200 μL，37℃，5% CO2培養。待細胞融合后，第4天更換培養液，第7天篩選融合細胞（取細胞上清，采用間接ELISA法篩選融合細胞），用酶標儀在450 nm測定吸收值，陽性/陰性值（P/N）大于2.1作為陽性細胞。通過有限稀釋法進行3-4次亞克隆。

1.2.6 單克隆抗體的純化 取3只適齡的Balb/c小鼠，預先腹腔注射0.5 mL石蠟制敏小鼠，1周后腹腔注射雜交瘤細胞（2×106個/0.5 mL），觀察腹水產生情況，10 d后收集腹水。4℃，12 000 r/min，離心30 min，收集上清，0.45 μm濾膜過濾，4℃保存待用。收集的腹水樣品先用等體積的10 mmol/L PBS（pH 7.4±0.2）溶液稀釋，protein G親和層析柱純化，先用10 mmol/L PBS（pH 7.4±0.2）預平衡層析柱10個柱體積，然后上稀釋后腹水樣品，上樣結束后再用PBS溶液平衡至基線穩定。用0.1 mol/L甘氨酸溶液（pH 3.0）洗脫，收集樣品，離心管中預先加入1 mol/L Tris溶液（pH 9.0），收集的蛋白樣品用超濾管（截留分子量10 kD）進行濃縮換液。收集的蛋白溶液純度采用SDS-PAGE法檢測。

1.2.7 單克隆抗體的分析檢測

1.2.7.1 ELISA法測定抗體效價 將純化的FGF20蛋白包被 ELISA 板（5 μg/mL，100 μL/孔），4℃孵育過夜，洗滌液洗板3次，用封閉液稀釋待測抗體，加入到ELISA板中100 μL/孔，稀釋倍數分別為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800，100 μL/孔，37℃孵育 40 min，洗滌液洗板3次，再加入山羊抗鼠IgG-HRP二抗（稀釋比例為1∶8 000）100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗滌液洗板3次；加TMB顯色液100 μL/孔，室溫避光孵育3-10 min，每孔加50 μL終止液終止反應，用酶標儀在450 nm下檢測每孔吸收值。

1.2.7.2 抗體亞型分析 按照sigma鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒使用說明書，檢測純化后的抗體，鑒定單克隆抗體的亞型，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.7.3 Western Blotting檢測 配制12%的SDSPAGE膠，將等量純化FGF20蛋白與商品化FGF20上樣進行電泳，電泳結束后，將目的蛋白轉印到PVDF膜上（恒流300 mA，1 h），然后用封閉液（含5%脫脂奶粉+TBST）溶液室溫封閉PVDF膜1-2 h，加入封閉液稀釋后的純化抗體（1∶5 000稀釋），4℃孵育過夜，第2天用TBST溶液洗滌PVDF膜3次后，加入用TBST溶液稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgGHRP二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h后，TBST溶液洗滌3次，最后用ECL曝光液曝光。用伯樂ChemiDoc MP凝膠成像系統拍照檢測。

1.2.7.4 Surface Plasmon Resonance（SPR）測定抗體親和力 SPR實驗使用BIAcore T200儀器，在HBSEP緩沖液（10 mmol/L HEPES、150 mmol/L NaCl、3 mmol/L EDTA、0.005%聚山梨醇酯20，pH 7.4）中進行。通過胺偶聯反應將FGF20蛋白固定在CM5芯片上，使其保持充分的配體結合能力。采用控制流通道作為基準面進行體效應的減法。增加濃度的抗體注射對固定化和參考通道，然后用再生液（2 mol/L NaCl，10 mmol/L醋酸鈉，pH 4.5）處理芯片。最后用BIA Evaluation軟件對數據進行評估，根據擬合的飽和結合曲線計算平衡離解常數Kd。

2 結果

2.1 重組蛋白的誘導表達和純化

構建的重組質粒經Nde I、BamH I雙酶切后，DNA電泳結果顯示（圖1），在1 000 bp附近處有一條明顯的條帶，與預計大小相符。工程菌pET24a-SUMO-hFGF20經過IPTG誘導后，SDS-PAGE結果顯示，在相對分子量為37 kD出現一條明顯的條帶，與預期結果一致，顯示目的蛋白在上清中表達（圖2）。均質破碎后離心樣品通過鎳NTA親和層析柱，捕獲到SUMO-FGF20融合蛋白，按比例用SUMO酶酶切后，樣品再經過鎳NTA親和層析柱，收集穿出液即獲得目的蛋白（圖3）。

圖1 質粒雙酶切圖Fig.1 Double enzyme digestion of plasmid

圖2 工程菌可溶性分析電泳圖Fig.2 Electrophoregram analysis of soluble of engineere bacteria (SDS-PAGE)

圖3 FGF20純化電泳圖Fig.3 Electrophoregram analysis of purified FGF20

2.2 抗體的純化

通過多次有限稀釋進行克隆化篩選，獲得1株穩定分泌表達FGF20單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為17G3。將雜交瘤細胞株擴增培養后，注射到小鼠腹腔內誘發產生腹水，收集腹水并分離純化。還原型SDS-PAGE結果顯示（圖4），分子量為25 kD和50 kD有兩條帶，分別對應抗體的輕鏈與重鏈。通過凝膠成像軟件分析，純度達到95%以上。

圖4 抗體純化電泳圖Fig.4 Electrophoregram analysis of purified monoclonal antibody

2.3 單克隆抗體的檢測

2.3.1 抗體效價和亞型的分析檢測 收集雜交瘤細胞產生的小鼠腹水，用間接ELISA檢測（n=3）純化后17G3抗體效價，以樣品OD450大于等于陰性對照OD值2.1時，所對應的最大稀釋倍數為抗體的效價，結果顯示純化后抗體效價為1∶25 600（圖5），經ELISA亞型檢測后，雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體亞型為IgG1（圖6）。

圖5 抗體效價分析檢測Fig.5 Antibody titer assay

圖6 抗體亞型分析檢測Fig.6 Antibody subgroup assay

2.3.2 Western Blot分析檢測 Western Blot結果顯示（圖7），在相對分子量為23 kD處可以曝光出條帶，且兩條帶位置相同，說明免疫純化得到的17G3抗體既可以與自制的抗原結合，又能與商品化的FGF20抗原結合，抗原抗體特異性較好。

圖7 Western Blot分析Fig.7 Western Blot assay

2.3.3 表面等離子共振技術（SPR）檢測抗體與FGF20結合動力學特性 將FGF20抗原偶聯到CM5芯片上，利用BIAcore T200 system對抗原抗體進行親和力檢測，檢測結果顯示離解速率常數（Kd）為1.07×10-7mol/L（圖8），結果表明17G3抗體與FGF20表現出極強的親和力和穩定性。可以用于后續癌細胞的診斷或者靶向治療。

圖8 SRP檢測抗體與FGF20結合動力學特性Fig.8 Kinetic assay on antibody binding to FGF20 antigen by SPR

3 討論

目前隨著惡性腫瘤的發病率不斷增高，腫瘤疾病的診斷，治療方法也在不斷進步，單克隆抗體由B淋巴細胞克隆產生，具有高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。在疾病研究及診斷中，單克隆抗體由于其特異性強、均一性好、可大量生產等優點，廣泛應用于感染性疾病的診斷、腫瘤診斷及預后判斷等方面。作為治療性抗體藥物，由于專一性強、療效顯著，也可以攜帶特定藥物，通過靶向作用到特定作用位點，用來干預癌癥發生發展過程中的各個信號通路，成為近年來研究的熱點藥物之一。因此，單克隆抗體是重要的研究工具，診斷試劑和臨床治療手段。目前國內科研，生產檢測所用到的單克隆抗體，基本為國外進口壟斷，價格不菲，因此自主研發制備高質量的單克隆抗體顯得十分重要。

有研究表明，FGF20可以與不同的受體結合，從而產生不同的功能。FGFR2介導的信號途徑在癌癥發展的過程中起到重要作用，FGF20可以與FGFR2結合，從而激活一系列信號活動，進而影響腫瘤的發生發展［21-23］。Chamorro等［24］發現，FGF20是β-catenin的直接下游靶基因，突變的β-catenin能使RK3E細胞發生致瘤性轉化，說明在Wnt信號通路中，FGF20是促使腫瘤形成的關鍵因素。Katoh等［25］研究顯示，在胃腸道中，FGF18、FGF20和SPRY4是Wnt信號通路的有效靶點。另外，Katoh［26］研究發現 FGF20、JAG1 和 DKK1 是 Wnt/βcatenin信號級聯的靶基因，Wnt和FGF信號通路的串擾增強了β-catenin和NFAT信號級聯。同時姜治國［27］發現，FGF20高表達在肝癌的發生發展過程中有重要的生物學作用，可能是Wnt/β-catenin信號通路被異常激活。Wnt/β-catenin信號通路的負調節的表觀遺傳沉默和功能突變存在于多種人類癌癥中，這可能是由于β-catenin的累積導致細胞膜上的表達量減少［23］。目前關于FGF20的單克隆抗體的研究，未見相關報道。總之，隨著不斷的深入研究，制備抗FGF20單克隆抗體，無論是作為腫瘤診斷，還是作為靶向治療都具有潛在的臨床應用價值。

本研究通過大腸桿菌原核表達系統，成功構建表達FGF20工程菌，經過誘導表達，分離純化獲得了高純度的目的蛋白，通過免疫小鼠制備鼠單克隆抗體，有限稀釋法篩選獲得了1株陽性雜交瘤細胞株，抗體經過ELISA效價，WB和SPR檢測，結果顯示可以與自制的FGF20目的蛋白和商品化的FGF20蛋白結合，自制單克隆抗體與FGF20目的蛋白的親和力Kd值達到1.07×10-7mol/L。該雜交瘤細胞株表達的抗體，可用于對組織細胞中FGF20蛋白表達檢測，癌細胞診斷，或者靶向治療等研究。本課題組后續會進一步進行FGF20單克隆抗體的篩選、配對和FGF20多克隆抗體的制備工作，為開發快速檢測FGF20的檢測試劑盒做準備。

4 結論

本研究通過構建表達FGF20的原核載體，并在大腸桿菌BL21（DE3）plysS中進行表達，通過分離純化獲得重組蛋白，通過免疫小鼠，有限稀釋法進行單克隆篩選，獲得1株穩定分泌抗體的陽性雜交瘤細胞株，通過ELISA、WB等對抗體進行分析鑒定。