肝癌相關成纖維細胞中生長抑素的表達水平與患者預后的關系研究

鄭倩婧 劉亞飛 闕穎釗 于衛華

肝細胞癌是一種高致死率的惡性腫瘤，是全球癌癥相關死亡的第四大原因，其發病率呈穩步上升趨勢[1]。肝癌的高侵襲性和轉移性阻礙腫瘤的徹底清除，是預后不良的關鍵因素[2]。因此，更全面地了解肝癌的侵襲和轉移機制是確定有效治療靶點的關鍵。腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)是腫瘤周圍基質的主要成分，通過與腫瘤細胞相互作用和對基質細胞外基質的機械重塑，誘導腫瘤細胞遷移和侵襲，促進腫瘤向惡性腫瘤發展和轉移擴散[3]。

生長抑素(somatostatin，SST)是一種主要由下丘腦產生的激素，通過人體許多特定的受體在激素調節中起著不同的作用，在許多不同的組織和腫瘤細胞中發現有SST受體轉錄本的存在[4]。研究報道CAFs參與肝癌的轉移與侵襲，但具體作用機制仍需要進一步明確[5]。SST對腫瘤生長的影響可能是通過抑制生長因子和促生長激素的合成或分泌而產生的間接作用，而CAFs則可分泌多種細胞因子來促進腫瘤進展[6-7]。因此，本研究探討了SST在CAFs中的表達及其與肝癌患者臨床病理參數、預后間的關系，并對SST和肝癌細胞間的作用機制進行初步探討，以期為臨床研究提供新靶點。

材料與方法

一、基本資料

收集空軍軍醫大學第一附屬醫院2015年4月至2016年10月接受肝癌手術的83例患者的肝癌及癌旁組織(距離癌組織>3 cm)樣本，肝癌組織樣本中男性43例，女性40例，平均年齡(57.54±3.21)歲。收集患者的臨床病歷資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移及組織分化程度。所有納入標本經病理學診斷均為肝細胞肝癌，患者術后采用門診或者電話等形式進行定期隨訪，時間為每2個月一次，為期60個月，隨訪時間截至2020年3月，統計肝癌患者術后無進展生存期(PFS)和總體生存時間(OS)，比較術后生存率。所有患者均具有完整的隨訪資料，且術前均獲得知情同意。本研究均經本院倫理委員會批準。

二、研究方法

(一)細胞培養 肝癌Huh7細胞購于上海中國科學院細胞庫。CAFs和正常成纖維細胞(NFs)分別從肝癌及癌旁組織樣本中分離：將組織剪成小塊后加入適量含有20 %胎牛血清(Thermo公司)的RPMI 1640培養液(Thermo公司)培養，待細胞鋪滿后進行傳代換液，換成正常培養液，取第4～7代纖維細胞進行試驗。所有細胞正常培養均用含有10 %胎牛血清、1 %青霉素鏈霉素(Gibco公司)的RPMI 1640培養液在37 ℃和5% CO2濃度的培養箱(上海精密儀器儀表有限公司)中培養。

(二)qPCR檢測肝癌組織中SST的表達水平 使用Trizol試劑從細胞中提取總RNA。然后用primerscript RT試劑盒將等量的RNA反轉錄成cDNA，并作為RT-qPCR的模板。使用SYBR Premix二聚體試劑盒(中國大連Takara)測定基因表達。在25 μL反應體積內合成cDNA，其中12.5 μL SYBR預混劑Ex-TaqⅡ，1.0 μL RT引物和1 μL cDNA樣品，10.5 μL雙蒸餾水，qPCR程序在實時PCR系統上進行，條件如下：95 ℃ 1 min，95 ℃ 35個循環20 s，然后56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCT方法分析靶基因的相對表達量，以GAPDH作為內參對照。實驗重復三次，取平均值。引物序列見表1。

表1 PCR反應引物序列

(三)細胞轉染、增殖與侵襲 細胞轉染采用Lipofectamine 3000轉染試劑。CAFs 以1×105個細胞接種到24孔板中，待細胞密度達到70 %左右時，將2.5 μg的SST過表達載體(pcDNA-SST，美國Santa公司)與對照物(vector，美國Santa公司)分別于5 μL Lipofectamine RNAiMA共同混合在125 μL的無血清培養液中，然后與細胞共孵育。

采用CCK-8測定法檢測肝癌細胞增殖。肝癌相關成纖維細胞轉染pcDNA-SST培養24 h后，取其上清液與肝癌細胞共培養，在0、24、48、72 h后，向每個孔中加入10 μL CCK-8(上海儒安生物科技)溶液并與細胞共孵育另外2 h。在37 ℃下，用SpectraMax iD3多功能酶標儀(美谷分子儀器有限公司)在450 nm波長處檢測吸收值。

將CAFs 以1×105個細胞接種到Transwell小室上層，下層接種Huh7細胞。共孵育24 h后，用棉簽除去未侵入的細胞，同時將侵入的細胞用4 %多聚甲醛中固定30 min，并用0.1 %結晶紫染色15 min。使用光學顯微鏡隨機選擇5個區域定量染色的細胞。

(四)酶聯免疫吸附試驗 CAFs過表達SST后24 h，收集上清液與Huh7細胞共孵育24 h，然后在4 ℃以10 000 r/min離心5 min，通過ELISA試劑盒檢測上清液中趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21、CXCL25的含量。

(五)免疫蛋白印跡 用PBS洗滌細胞兩次后用RIPA裂解緩沖液(碧云天生物科技)裂解，蛋白質濃度用BCA蛋白質分析試劑盒(Sigma公司)測定。然后用10 % SDS-PAGE分離等量的總蛋白，并轉移到PVDF膜上。在室溫下用5 %脫脂牛奶封閉2 h，然后在4 ℃下與一抗(Wnt1，1∶1 000稀釋，ab15251；β-catenin，1∶1000稀釋，ab32572；Cyclin D1，1∶200稀釋，ab16663；c-Myc，1∶500稀釋，ab32072，英國Abcam公司)孵育過夜。用TBS-T洗滌3次后，在室溫下與辣根過氧化物酶(1∶1000 稀釋, ab20272)共孵育1 h。用ECL成像系統(上海嘉鵬科技有限公司)顯示蛋白質條帶，用imagej軟件定量蛋白質條帶的光密度。

三、統計學分析

結 果

一、α-SMA、Vimentin及SST在 CAFs中的表達水平

如表2所示，采用qPCR檢測CAFs標志物(α-平滑肌肌動蛋白，α-SMA；波形蛋白，Vimentin)及SST的相對表達水平。結果顯示相對于NFs、α-SMA和Vimentin在CAFs中的表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.001)。然而，SST在CAFs中的mRNA水平顯著低于NFs組，差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 α-SMA、Vimentin及SST在 NFs和CAFs中的表達水平

二、 SST的表達與肝癌患者病理特征的關系

如表3所示，在83例肝癌患者中，男性43名例，女性40例；年齡在41～67歲之間，平均年齡為(57.54±3.21)歲；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期的有21例，Ⅲ+Ⅳ期的62例；淋巴結轉移患者51例，淋巴結未轉移的32例；組織分化程度低的19例，組織分化程度中、高度的共64例。

表3 SST的表達與肝癌患者臨床病理參數的關系

肝癌患者按照SST表達分為SST高表達組(SST≥0.462)和SST低表達組(SST<0.462)。SST與臨床病理特征的關系顯示，SST的表達與患者的年齡、性別和腫瘤大小無關(P>0.05)，與TNM分期、是否淋巴結轉移及組織分化程度相關(P<0.05)。TNM分期高(Ⅲ+Ⅳ)、淋巴結發生轉移、肝癌組織分化程度中/高的患者，CAFs 中SST的表達水平越低；而TNM分期低(Ⅰ+Ⅱ)、淋巴結未發生轉移、組織分化程度低的肝癌患者，CAFs 中SST的表達水平偏高。

三、 SST對共培養肝癌細胞增殖的影響

從表4可知，與NFs細胞相比，培養CAFs的上清液與Huh7細胞共孵育后可顯著促進肝癌細胞的增殖，差異有統計學意義(P<0.05)；而CAFs過表達SST后再與Huh7細胞共培養，與Vector組相比，pcDNA-SST組Huh7細胞的增殖受到抑制，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表4 SST對共培養肝癌細胞增殖的影響

四、SST對共培養肝癌細胞侵襲的影響

比較肝癌細胞侵襲數發現，與Vector組(342±14)相比，過表達SST的CAFs與Huh7細胞共孵育，可顯著抑制Huh7細胞的侵襲數量(98±10)，差異具有統計學意義(t=24.564，P<0.001)。

五、過表達SST對趨化因子的影響

為探討SST是如何通過CAFs影響Huh7細胞的增殖與侵襲，本文采用ELISA試劑盒檢測培養NFs和CAFs上清液中趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21和CXCL25的表達水平。結果顯示四種趨化因子CCL2(98.50±3.98)pg/mL、CCL5(78.32±4.21)pg/mL、CXCL21(24.32±5.11)pg/mL和CXCL25(20.34±4.77)pg/mL的表達水平在CAFs上清液中的表達水平顯著高于NFs組(3.2±5.36,1.40±4.35,1.02±4.67,1.11±5.01)pg/mL， 差異具有統計學意義(均P<0.05)。表5顯示，與Vector組相比，趨化因子在轉染pcDNA-SST組中的含量顯著降低，差異有統計學意義。

表5 過表達SST對趨化因子的影響

六、SST通過抑制Wnt/β-catenin通路抑制肝癌細胞的轉移

Wnt/β-catenin通路被報道參與多種腫瘤的發生發展，因此我們通過Western blot實驗檢測Wnt/β-catenin通路是否參與SST對肝癌的抑制。表6結果顯示，與vertor組相比，CAFs轉染pcDNA-SST后，可顯著抑制Wnt/β-catenin通路相關蛋白Wnt1、β-catenin、Cyclin D1和c-Myc的表達(P<0.01)，說明SST通過Wnt/β-catenin通抑制Huh7細胞的增殖與侵襲。

表6 SST對Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響

七、SST的表達與肝癌患者預后的關系

Kaplan-Meier法被用來分析SST的表達與肝癌患者預后(PFS、OS)的關系。高表達SST的肝癌患者PFS(41.04%)、OS(39.77%)均顯著高于低表達SST肝癌患者PFS (8.27%)、OS(6.31%)，差異有統計學意義(χ2=4.679，P=0.031；χ2=4.304，P=0.038)。

討 論

腫瘤微環境中的細胞相互作用是腫瘤進展的關鍵因素，CAFs是腫瘤微環境的組成部分之一，其通過分泌各種生長因子和細胞因子，或與癌細胞的相互作用為腫瘤侵襲和轉移創造了有利的微環境，從而促進腫瘤進展[8]。本文研究發現當CAFs與肝癌細胞共培養時，同樣可促進肝癌細胞的增殖與侵襲，說明CAFs也參與肝癌的發生發展。

SST是一種參與多種生物化學和信號轉導途徑的肽，通過激活其同源受體負調控細胞增殖和多種激素的釋放，具有抗分泌、抗增殖和抗血管生成的作用，因此，在人類疾病治療方面特別是腫瘤具有優異的效果[9]。天然的SST因為臨床應用半衰期短的原因而受到抑制，因此現階段的臨床研究多是其類似物，如SST的類似物奧曲肽，臨床治療顯示服用14.3個月后可顯著延緩腫瘤的進展，表現出突出的抗增殖作用，且患者預后也較好[10]。本研究發現，SST在CAFs中的表達水平顯著低于正常成纖維細胞，通過在CAFs中構建SST的過表達載體，再與肝癌細胞共培養后，可顯著抑制肝癌的增殖與侵襲，說明SST通過抑制CAFs與肝癌細胞的相互作用，抑制肝癌細胞的增殖與侵襲。

細胞因子/趨化因子家族在調節腫瘤進展和癌細胞間質相互作用中同樣占據重要的位置。在口腔鱗狀細胞癌，CAFs通過增加單核細胞趨化蛋白1(MCP-1/CCL2)的表達促進腫瘤的侵襲和遷移[11]。在涎腺腺樣囊性癌中CAFs條件培養基對ACC細胞遷移和侵襲有顯著促進作用，通過干預基質金屬蛋白酶和CXCL12/CXCR4途徑，可以抑制CAFs促進的ACC侵襲[12]。Wnt/β-catenin信號通路是調控細胞增殖、分化和腫瘤發生的經典信號通路，可通過調控EMT的進展參與腫瘤發生[13]。Shan等人報道Wnt/β-catenin信號通路是CXCL12過表達乳腺癌細胞上皮向間充質轉化所必需的。因此當CAFs與肝癌細胞培養時，趨化因子CCL2、CCL5、CXCL21、CXCL25和Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達水平顯著增加，而在CAFs中過表達SST后，四種趨化因子和Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達受到抑制，說明SST是通過增加趨化因子和激活Wnt/β-catenin信號通路參與肝癌的發展。

綜上所述，本研究發現SST在肝癌患者癌旁組織的CAFs中表達下調，SST與肝癌患者臨床病理因素及預后相關，過表達SST可抑制肝癌細胞的增殖與侵襲，其機制可能與SST抑制CAFs分泌的趨化因子和肝癌細胞Wnt/β-catenin信號通路有關。