熒光探針用于食品添加劑定量分析的實驗設計

張建坡，金 麗，金 星，張志會，鐘方麗，馬明碩

(吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022)

分析化學從分析的原理方面分，可以分為化學分析和儀器分析，它的主要任務是根據物質運動和變化的理論，創建有關的實驗技術、研制儀器設備、制定分析方法，它對國民經濟的發展、國防力量的壯大和科學技術的進步各方面有著舉足輕重的作用[1-2]。分析化學實驗為我校化學類專業的必修課程。目前，主要內容以滴定分析、色譜實驗、電化學實驗為主，這些實驗內容與基礎實驗相類似，缺乏創新性；而光譜類實驗(傅里葉紅外光譜實驗和紫外可見吸收光譜實驗)主要為驗證性實驗，缺乏與實際生活的聯系，導致學生學習興趣下降，未能取得良好的教學效果[3-5]。近年來，熒光探針，基于量子點類熒光強度的變化對食品添加劑進行定量分析，被廣泛研究[6-11]。因此，結合教師科研課題，基于胭脂紅對石墨烯量子點的熒光猝滅作用，引導學生設計并完成一種熒光猝滅法定量分析飲料中胭脂紅含量的分析方法的研究型實驗。本實驗內容包括實驗條件的選擇(溶液酸度和反應時間對反應的影響)、工作曲線的建立、猝滅機理的探討和實際樣品的分析，使學生不僅學會使用熒光分光光度計，而且學會利用origin軟件對熒光數據進行處理和分析。

一、實驗儀器和試劑

(一)實驗儀器

天津港東F-280熒光分光光度計；島津UV-2550紫外可見分光光度計；德國IKA RCT恒溫磁力攪拌器和部分小型玻璃儀器，均為實驗室常用儀器。

(二)實驗試劑

胭脂紅購自天津開復化學試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均購自國藥集團化學試劑有限公司。所有的試劑均為分析純，使用前未做任何處理。

二、實驗教學方案設計

(一)溶液配制

(1)通過檸檬酸裂解法得到濃度為0.5 mg·L-1的石墨烯量子點，已為學生準備好樣品，樣品的平均熒光壽命為6.14 ns。

(2)準確稱取0.01 g胭脂紅固體，定容于100 mL容量瓶中，得到胭脂紅儲液(0.1 g·L-1)。

(3)配制濃度均為0.1 mol·L-1的氫氧化鈉和鹽酸溶液；準確配置pH=7.0、C=1 mol·L-1的緩沖溶液(使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉)。

(二)熒光發射光譜的測定和紫外-可見吸收光譜的測定

熒光光譜測試條件：激發狹縫和發射狹縫均為5 nm，激發波長為367 nm，測試范圍為400～650 nm；紫外-可見吸收光譜測試范圍300～650 nm。

(三)實驗條件的選擇

1.溶液酸度的影響

取10個比色管，向其中均加入0.1 mL石墨烯量子點和40 μL的胭脂紅儲液，將加入胭脂紅的溶液用鹽酸和氫氧化鈉溶液依次調節溶液pH為2～11后，定容至10 mL，得到1～10號溶液，室溫下孵育5 min后，測得熒光發射光譜。

同時，取10個比色管，向其中均加入0.1 mL石墨烯量子點，用鹽酸和氫氧化鈉溶液依次調節溶液pH為2～11后，定容至10 mL，得到1～10號溶液，室溫下孵育5 min后，測得熒光發射光譜，作為對照熒光強度。

2.反應時間的影響

取2個比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子點，分別向其中加入0 μL和40 μL的胭脂紅儲液，用pH為7的緩沖溶液定容至10 mL，得到1和2號溶液，每隔2 min測一次2號溶液的熒光發射光譜，測1號溶液的熒光發射光譜作為對照。

(四)猝滅機理探討

1.UV-vis吸收光譜

取2個比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子點，分別向其中加入0 μL和40 μL的胭脂紅儲液，用pH為7的緩沖溶液定容至10 mL，得到1和2號溶液，分別測得兩個溶液的紫外-可見吸收光譜。

2.變溫實驗及kq值的比較

取6個比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子點，并加入一系列體積(0、10、20、30、40和50 μL)的胭脂紅儲液，用pH為7的緩沖溶液定容至10 mL，得到1～6號溶液，室溫下孵育5 min后，將溶液依次置于20和30 ℃水浴中10 min后，測得熒光發射光譜。

根據Kq=KSV/τ0，其中KSV由變溫實驗的斜率求得，τ0=6.14 ns(樣品的平均熒光壽命)，求得kq值再與最大擴散碰撞速率常數(2.0×1010L·mol-1·s-1)進行比較。

(五)標準曲線的繪制

取8個比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子點，并加入一系列體積(0、10、20、30、40、50、60和70 μL)的胭脂紅儲液，用所配置的緩沖溶液統一定容至10 mL，在經過5 min室溫孵育后，分別測定其熒光發射光譜。

(六)實際樣品分析

(1)移取20 mL飲料于50 mL燒杯中，置于電爐上微沸10 min以去除溶液中的二氧化碳，冷卻后，備用，得樣品A溶液。

(2)取2個比色管，先加入石墨烯量子點0.1 mL，再分別加入樣品A溶液0 mL和0.4 mL，用pH為7的緩沖溶液定容至10 mL，5 min后測得熒光發射光譜，并根據標準曲線計算得到樣品中胭脂紅的含量，單位為g/mL。

三、實驗結果與討論

(一)溶液酸度和孵育時間對反應的影響

首先研究了pH值對反應體系熒光強度(F0/F)的影響(圖1)。F0/F值隨著pH值的增大呈現而先增大后減小的趨勢，在pH=7時出現最大值，因而測試pH值定為7；其次研究了孵育時間對F0/F的影響。當孵育5分鐘后，該體系的熒光強度變化(F0/F)趨于平穩，因而選擇孵育時間為5分鐘。

pH

(二)猝滅機理探討

1.UV-vis吸收光譜

打開電腦和紫外-可見分光光度計，測試前預熱20 min。雙擊測試軟件圖標，儀器完成自檢后，設置測試范圍為200～800 nm，先測空白溶液得到基線，之后測試樣品。

測試結果如圖2所示，未加入胭脂紅時GQDs的紫外吸收峰位于334 nm(黑線)，加入胭脂紅后，GQDs的紫外吸收峰發生了明顯的藍移(紅線)，這表明GQDs和胭脂紅之間形成了新的復合物。

Wavelength/nm

2.變溫實驗

選取20 ℃、30 ℃和40 ℃3個溫度進行實驗測定。依據方程F0/F=KSV[C]+b對所測熒光光譜數據進行分析，其中F0代表GQDs的熒光強度，F為加入胭脂紅后GQDs的熒光強度，C表示胭脂紅的濃度。隨著孵育溫度的增加，擬合直線的斜率依次減小，這是因為隨著溫度增加，所形成的石墨烯量子點/胭脂紅復合物的穩定性依次減弱。

3.比較kq值

通過方程Kq=KSV/τ0計算，τ0=6.14 ns。通過計算可知20 ℃時KSV為1.60×105(R2為0.997)，則Kq為2.6×1014mol·L-1·s-1，30 ℃時KSV為1.47×105(R2為0.989)，則Kq為2.4×1014mol·L-1·s-1，40 ℃時KSV為1.29×105(R2為0.991)，則Kq為2.1×1014mol·L-1·s-1該數值遠遠大于2×1010mol·L-1·s-1(最大動力學猝滅常數)。

綜上，依據紫外吸收光譜分析、變溫實驗分析和kq值的比較，從理論上可以判定胭脂紅對GQDs的熒光猝滅為準靜態猝滅過程。其反應機理可以闡述如下：胭脂紅作為一種有機染料，每一個分子均具有—SO3-和—OH基團，而石墨烯量子點表面具有—COOH，石墨烯量子點表面的—COOH與胭脂紅表面的—SO3-之間具有較強的相互作用(如圖3所示)，因而形成二者的復合物，引發GQDs基態化合物的能量散失，造成GQDs熒光發射強度降低，即GQDs的熒光猝滅。

圖3 石墨烯量子點與胭脂紅作用機理模擬圖

(三)標準曲線的繪制

在最優條件下，發現胭脂紅濃度為0.165 6～1.158 9 μmol·L-1的范圍內，石墨烯量子點熒光強度的降低(F0/F)與胭脂紅濃度之間具有良好的線性關系(如圖4所示)，回歸方程為F0/F=1.905 3[胭脂紅]+ 0.742 1，相關系數為0.997。通過方程LOD=(3.3 σ·k-1)計算得檢出限(LOD)為0.052 34 μmol·L-1，σ代表標準偏差，k代表回歸方程的斜率。通過5次重復檢測1.5 μg·L-1的胭脂紅，得到相對標準偏差(2.8%)，說明該方法具有良好的重復性。

Concentration of Ponceau 4R/(μmol·L-1)

(四)實際樣品分析

1.做圖法求算飲料中胭脂紅的含量

如圖5所示，實際樣品引起的GQDs熒光強度變化的F0/F值為1.968 8，通過做圖法可知胭脂紅的濃度為0.643 8 μmol·L-1；該濃度為原飲料溶液0.4 mL定容至10 mL，稀釋后所含胭脂紅的濃度，原飲料中含有胭脂紅的濃度應換算為0.643 8×604×10-4/4=9.721 mg·L-1。通過本實驗讓學生學會使用origin做圖，掌握標準曲線法作圖法求算未知樣品的含量。

Concentration of Ponceau 4R/(μmol·L-1)

2.計算法求算飲料中胭脂紅的含量

依據F0/F=1.968 8，根據回歸方程F0/F=1.905 3[胭脂紅]+ 0.742 1，胭脂紅的濃度為0.643 8 μmol·L-1；該濃度為原飲料溶液0.4 mL定容至10 mL，稀釋后所含胭脂紅的濃度，原飲料中含有胭脂紅的濃度應換算為0.643 8×604×10-4/4=9.721 mg·L-1。

四、結 語

通過食品添加劑對石墨烯量子點熒光強度變化的實驗探究，設計了一個定量分析飲料中胭脂紅含量的綜合型實驗。在實驗過程中，學生需要獨立完成溶液的配制、儀器調試、測試和實際樣品分析等工作；實驗結束后需運用origin軟件完成做圖、對實驗數據進行分析處理，以及結合譜圖和計算結果完成對反應機理的探討，提高了學生的動手能力和解決實際問題的能力。將教師科研課題引入到本科生教學中，讓學生了解到科學研究最終的目的是為了解決生活中的實際問題，使學生體會到學以致用的樂趣。