一個戈謝病Ⅱ型中國家系GBA基因突變分析及文獻復習

黃霜?陳素琴

【摘要】目的 鑒定一個戈謝病Ⅱ型中國家系中GBA基因的致病性突變。方法 收集1例戈謝病Ⅱ型10個月女性患兒的臨床及家系資料，提取該先證者及其父母外周血DNA，采用PCR擴增GBA基因的11個外顯子及剪接位點序列，對PCR產物進行直接測序;對先證者及其父親的包含第6外顯子變異位點的基因序列進行克隆測序。以 “Gaucher disease”“GBA” 和“mutation”為檢索詞對dbSNP、ClinVar、HGMD和PubMed等數據庫進行檢索，收集并分析檢索到的攜帶GBA c.680_681delATinsGG突變的病例資料。結合該家系先證者的臨床資料以及美國醫學遺傳學與基因組學學會和分子病理學協會（ACMG/AMP）的指南進行罕見突變的致病性鑒定。結果 該家系先證者GBA基因有2個復合雜合性突變：遺傳自父親的第6外顯子的c.680_681delATinsGG（p.N227R）突變和遺傳自母親的第10外顯子的c.1448T > C（p.L483P）突變。克隆測序驗證了先證者及其父親的c.680_681位點有2種單體型：突變的GG和正常的AT。c.680_681delATinsGG為罕見突變，尚未有研究對該突變進行致病性鑒定。隨訪顯示先證者有運動、智力進行性減退以及驚厥發作和喂養困難，于出生后16個月因喂養時嗆咳、窒息死亡。目前在數據庫僅檢索到2例患者攜帶該突變，其中1例患病資料缺乏，另外1例為中國戈謝病Ⅱ型患兒。根據ACMG/AMP的指南，該變異分類為“致病性的”。結論 GBA基因的c.680_681delATinsGG和c.1448T > C復合雜合性突變導致該家系的先證者患病，c.680_681delATinsGG為致病性突變，c.680_681delATinsGG/c.1448T > C基因型與戈謝病Ⅱ型相關。

【關鍵詞】戈謝病;Ⅱ型;? GBA基因;致病性突變

Analysis and literature review of GBA gene mutations in a Chinese family with one member suffered from type 2 Gaucher disease Huang Shuang， Chen Suqin.Department of Laboratory， Panyu Hexian Memorial Hospital，Guangzhou 510530， China Corresponding author， Chen Suqin， E-mail： chensq@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To identify the pathogenic mutations of the GBA gene in a Chinese infant with type 2 Gaucher disease. Methods Clinical data and the family history of the proband， a 10-month-old affected female infant， were investigated. DNA was extracted from the peripheral blood of the proband and her parents. All 11 exons and the intron-exon splice sites of GBA gene were amplified by polymerase chain reaction （PCR）. Mutations were detected by direct sequencing the PCR products. The DNA sequence containing exon 6 variant of the proband and her father were cloned and sequenced. Using the keywords of “Gaucher disease” “GBA gene” and “mutation”， relevant literatures were searched from dbSNP， ClinVar， HGMD， PubMed and other relevant databases. Phenotypic data of these patients with the GBA c.680_681delATinsGG mutation were collected and analyzed. The pathogenicity of the rare mutation was identified by the clinical manifestations of the proband in combination with the ACMG/AMP guidelines. Results The proband was found to be compound heterozygous for two mutations in the GBA gene： c.680_681delATinsGG（p.N227R）mutation in the exon 6 from her father and c.1448T > C（p.L483P）in the exon 10 from her mother. Cloning and sequencing verified both the proband and her father carried mutant GG and normal AT haplotypes at c.680_681 sites. The c.680_681delATinsGG is a rare mutation， and its pathogenicity has not been identified. Subsequent follow-up revealed that the proband developed progressive deterioration in physical activity and intelligence， convulsion and difficulty in feeding， and died of cough and suffocation due to feeding at 16 months after birth. At present， only 2 patients with this mutation have been retrieved， and clinical data were lacking in 1 case and the other case was a Chinese child with type 2 Gaucher disease. According to the ACMG/AMP guidelines， the variation was classified as “pathogenic”. Conclusions The compound heterozygous c.680_681delATinsGG （p.N227R） and c.1448T > C （p.L483P） mutations lead to the incidence of type 2 Gaucher disease in the proband. c.680_681delATinsGG is a pathogenic mutation and c.680_681delATinsGG/c.1448T > C genotype is associated with type 2 Gaucher disease.

【Key words】Gaucher disease; Type 2; GBA gene; Pathogenic mutation

戈謝病又稱葡萄糖腦苷脂酶缺乏癥或葡萄糖神經酰胺貯積病，是一種罕見的遺傳代謝障礙性疾病。其代謝基礎為溶酶體內葡萄糖腦苷脂酶（GBA）缺乏， 導致其底物葡萄糖神經酰胺無法水解成葡萄糖和神經酰胺，大量的底物貯積在多種組織器官的單核巨噬細胞中，形成“戈謝細胞”，出現相應的臨床癥狀[1]。戈謝病的主要臨床表現為肝脾腫大、貧血、血小板減少、骨骼病變以及神經系統受累等。但患者臨床嚴重程度差異較大，輕者可無任何癥狀，重者可在圍產期死亡。根據臨床特征和病程，戈謝病通常被分為3種類型：Ⅰ型（非神經病變型）、Ⅱ型（急性神經病變型）和Ⅲ型（慢性或亞急性神經病變型）[1-3]。

戈謝病的主要致病基因為GBA基因（NM_0001005741），其確診依賴于GBA酶活性的測定或GBA基因分析。目前戈謝病在世界各地均有發病，但其發病率具有明顯的種族差異性。一般人群中，戈謝病發病率約1/40 000 ～ 1/ 60 000;而在Ashkenazi猶太人中，戈謝病Ⅰ型發病率高達1/850[4-5]。我國于1948年首次報道了該病，其后各地陸續有病例報告，但尚缺乏完善的流行病學數據。新生兒篩查數據顯示，臺灣地區新生兒發病率為1/103 134，上海地區新生兒發病率為1/ 80 855[6-7]。

病例研究顯示，我國戈謝病患者以Ⅰ型為主，Ⅱ型相對少見[8-13]。本文報道1例罕見的戈謝病Ⅱ型患兒的臨床表現及其家系的分子遺傳學分析結果， 以期為提高醫學同行們的診療水平提供參考。

對象與方法

一、1例戈謝病Ⅱ型患兒臨床資料的收集

本項目研究對象為1例臨床診斷為戈謝病Ⅱ型的女性患兒及其父母。收集并分析患兒的病史、體格檢查、實驗室及輔助檢查、治療等資料（患兒病歷資料由其家屬提供，應家屬要求隱藏部分涉及隱私信息）。

二、患兒及其父母的分子遺傳學分析

1. 基因組DNA的提取

經患兒家屬知情同意，并經中山大學倫理委員會批準后，取患兒及其父母外周血2 mL，按常規酚/氯仿/異戊醇抽提法進行DNA的提取。

2. GBA基因序列分析

對患兒及其父母的GBA基因的全部（11個）外顯子及其剪接位點進行直接序列分析。引物序列及PCR擴增按文獻操作[9，14]。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳、回收純化，直接測序。測序結果用Chromos Lite 2.1.1軟件分析，所得序列與數據庫中的GBA基因序列進行比對。變異位點的描述按人類基因組變異協會所推薦的命名法則[15]。

3. 包含變異位點的第6外顯子序列的克隆測序

采用TOPO TA 克隆技術，將患兒及其父親的包含GBA 基因第6外顯子的PCR擴增產物與TOPO 質粒載體連接后轉染大腸桿菌，接種于LB 固體平板并在37℃培養過夜，從中挑選出數個克隆轉移到LB 液體培養基中增殖，提取質粒DNA 進行測序鑒定，確定標本的單體型。

4. 罕見突變的數據庫檢索

以“gaucher disease”“GBA”和“mutation”為檢索詞在公共數據庫中檢索突變的收錄情況，包括dbSNP、ClinVar、ESP6500、ExAC、1000genomics、HGMD和PubMed。上述數據庫檢索的截止時間為2021年8月20日。

5. 罕見突變的致病性鑒定

利用PROVEAN、SIFT 和MutationTaster軟件預測突變對蛋白質功能的影響。根據2015年美國醫學遺傳學與基因組學學會和分子病理學協會（ACMG/AMP）變異分類指南對發現的罕見突變進行分類[16]。

結果

一、1例戈謝病Ⅱ型患兒的臨床資料

1. 基本情況及家族史

患兒女，漢族，10個月，足月，剖宮產娩出，出生體質量3.3 kg，出生時有窒息史，阿普加評分1 min 7分、5 min 10分，母親系孕1產1，妊娠期基本健康。患兒出生后母乳喂養，5月齡時添加輔食，9月齡時斷母乳。患兒2月齡會抬頭，4月齡會翻身，但豎直軀體時頭向后仰，10月齡會咿呀發音，會逗笑，會認人，但不會爬，坐不穩，生長發育落后于正常同齡兒。父母非近親婚配，身體健康。血緣親屬中無遺傳性代謝性疾病或其他遺傳病病史。

2. 入院主訴、病史及檢查

患兒因面色蒼白伴進行性腹脹5個月，咳嗽1周入院治療。患兒3月齡時開始出現反復發作性咳嗽、喘鳴和呼吸困難，家屬自行予“支氣管哮喘”藥物治療后癥狀緩解。患兒5月齡時出現面色蒼白，腹脹，繼而反復腹瀉，8次/日，呈水樣便，伴進行性腹脹，以“腹瀉病”在當地多家醫院診治，無明顯好轉。8月齡時加輔食（米糊）后腹瀉較前好轉，但漸出現舌喜外露，雙眼非共同性內斜視，無伴眼球震顫，雙眼球運動協調性欠佳，并出現流質食物吞咽困難、嗆咳，固體食物吞咽無異常，無伴嘔吐。9月齡時盜汗明顯，無易驚或畏寒發熱。入院1周前出現咳嗽、喘息、喉鳴，當地醫院診斷為“喘息性支氣管肺炎，貧血原因待查，運動發育落后，先天性喉喘鳴”，經抗感染及輸血治療后咳嗽較前好轉。

入院檢查：體質量 6.45 kg，身高66 cm，頭圍 43.5 cm，神志清晰，精神稍差，發育落后，全身皮膚黏膜蒼白，毛發稀黃，前囟1.5 cm×1.5 cm，眼球無突出及凹陷，雙眼非共同性內斜視，雙眼球運動協調性欠佳，無伴眼球震顫。雙肺呼吸音稍粗，未聞及干、濕啰音。腹部膨隆，肝下緣位于肋下5.5 cm，劍突下5.5 cm，質中，邊緣銳利，肝頸靜脈回流征陰性。脾肋下可觸及，Ⅰ線9.5 cm，Ⅱ線6.5 cm， Ⅲ線-2.5 cm，質硬。血常規：血紅蛋白 73 g/L，紅細胞3.2×1012/L， 白細胞5.2×109/L，紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC） 302.0 g/L， 平均紅細胞體積73.1 fL，平均血紅蛋白含量22.1 pg，?血小板計數46×109/L。腹部超聲檢查：肝腫大，脾Ⅱ度腫大。尿有機酸、血液氨基酸、染色體微陣列分析、EB病毒檢查均未見異常。白細胞溶酶體活性分析：β-葡萄糖苷酶活性[0.5 nmol/（h·mg）]

低于正常參考值[6.8 nmol/（h·mg）]的10%。結合臨床表現及實驗室檢查結果，初步診斷為戈謝病Ⅱ型。

3. 入院治療過程及隨訪

入院后給予抗感染及對癥治療，未再咳嗽，患兒家屬放棄進一步治療，住院8 d后要求出院。院外隨訪，患兒出現運動、智力進行性減退、驚厥發作和喂養困難，16月齡時因喂養時嗆咳、窒息死亡。

二、分子遺傳學分析

基因測序顯示，患兒GBA基因存在2個復合雜合性突變：c.680_681delATinsGG（p.N227R）和c.1448T > C（p.L483P）。其中位于第6外顯子的c.680_681delATinsGG，使第227位密碼子AAT變為AGG，導致正常的天冬酰胺（N）變為精氨酸（R），即 p.N227R錯義突變;位于第10外顯子的c.1448T > C突變，使第483位密碼子CCT變為CCC，導致正常的賴氨酸（L）變為脯氨酸（P），即p.L483P（圖1）。其中，c.680_681GG突變來自父親，父親為該突變的雜合子。克隆測序驗證了患兒和父親的c.680_681位點有2種單倍型：突變的GG和正常的AT（圖2）。患兒的c.1448T > C突變來自母親，母親為該突變的雜合子。該突變在此家系中的傳遞符合孟德爾遺傳規律，遺傳方式符合常染色體隱性遺傳病的特征。

三、罕見突變相關的文獻檢索

c.680_681delATinsGG的dbSNP數據庫編號為rs786200979;ClinVar數據庫顯示其為可能致病性突變 （likely pathogenic），審查狀態為1星突變（基于單個提出注釋功能的研究成果）。通過查詢該突變的提交信息，提示該變異為臨床檢測中發現的生殖系突變雜合子，但被檢測者的患病狀態不詳（http：//www.egl-eurofins.com/emvclass/emvclass.

php？approved_symbol=GBA）。在HGMD、ESP6500、ExAC和1000genomics數據庫均未檢索到該突變。在PubMed數據庫檢索到1例臨床確診的戈謝病Ⅱ型中國患兒，該患兒的基因型與本例患兒的基因型完全相同，其主要臨床表現為肝脾腫大、斜視、驚厥發作和生長發育遲緩等，于12月齡時死亡[10]。因此，c.680_681delATinsGG突變在患者組的頻率明顯大于健康人群。

四、本例患兒罕見突變的致病性鑒定

PROVEAN 、SIFT 和MutationTaster對c.680_ 681delATinsGG突變的預測結果分別為“有害的（deleterious）”“破壞性的（damaging）”和“致病性突變（disease causing）”。在HGMD、ClinVar以及PubMed等數據庫檢索發現，該突變同一氨基酸位置還存在另外3種不同的突變，分別為p.N227S （c.680A > G） 、p.N227I （c.680A > T） 和p.N227K （c.681T > G）突變，上述突變已證實是致病性突變。在患兒的復合雜合性突變中，另一突變c.1448T > C（p.L483P）已明確是致病性突變。

根據ACMG/AMP變異分類指南，GBA c.680_681delATinsGG突變滿足以下條件：PS4，突變在患者組的頻率明顯大于健康人群;PM2，即在ESP6500、1000genomics和 ExAC數據庫中的等位基因頻率為0，對于隱性遺傳的突變頻率允許為低頻;PM3，即對于隱性遺傳的突變，先證者檢出復合雜合突變，與其組成復合雜合的另一突變致病性已明確;PM5，即錯義突變所在的同一位置存在其他不同氨基酸變化的致病性突變，該突變便存在PM5證據;PP3，多項計算機模擬計算預測有害;PP4，突變相關的疾病與患者的臨床表型高度吻合。c.680_681delATinsGG突變滿足：1個PS 證據、3個PM證據及2個PP證據，該變異分類為“致病性的（pathogenic）”。

GBA基因的c.680_681delATinsGG和c.1448T >?C復合雜合性突變是本例戈謝病Ⅱ型患兒的致病原因。

討論

戈謝病Ⅱ型是戈謝病中最少見的類型，也稱“急性神經病變型”，除有貧血、肝脾腫大、骨骼損害等廣泛且嚴重的臟器受累外，還有嚴重的神經系統受累癥狀，如頸項強直、眼科損傷（如斜視和眼球運動不能）、吞咽困難、喉喘鳴、驚厥和癲癇發作等。患兒多在 1 歲以內發病，病情進展迅速，多于2歲前死亡。本例患兒3月齡時開始出現呼吸道受累癥狀，5月齡時出現消化道受累癥狀，10月齡時已有明顯的肝脾腫大、貧血、生長發育遲緩等;同時有嚴重的神經系統受累癥狀，病情進展迅速，于16月齡因喂養時嗆咳、窒息死亡。其β-葡萄糖苷酶活性極低，診斷為戈謝病Ⅱ型。

戈謝病常由GBA基因突變引起。GBA 基因位于1q21，全長跨度約7.6 kb，cDNA全長2564 bp，包含11個外顯子，編碼多肽鏈長度為497個氨基酸。GBA下游16 kb處有1個高度同源的假基因GBAP，易與GBA 基因發生同源重組導致序列的缺失或插入而致病[17-18]。在編碼區，GBA和GBAP的同源性達96%以上;在內含子8和3非翻譯區之間的區域，兩者同源性增加到98%左右;GBAP在外顯子9中缺少55 bp的片段，這是2個序列之間的主要外顯子差異。目前國際上報道的 GBA 突變約 581 種，突變主要類型為錯義突變，占75 %以上;其余突變依次為小片段缺失、剪接突變、基因重組、小片段插入、大片段的缺失或插入等。其中大部分突變在各群體中散在分布，但部分常見突變的分布具有群體差異性。在Ashkenazi猶太人中，最常見的突變是c.1226A >?G（p.N419S），其次為c.84-85ins G、c.1448T > C（p.L483P）、c.115+1G > A（IVS2+1G > A）。上述4種突變類型約占該群體戈謝病總突變類型的96%[4]。c.1226A > G（p.N419S）和c.1448T > C（p.L483P）是非Ashkenazi高加索人群最常見的突變，占該群體戈謝病總突變類型的62% [4]。相反， c.1226A >?G（p.N419S）突變在亞洲人群中少見。中國戈謝病患者GBA突變最常見的類型為c.1448T > C（p.L483P），占中國總突變類型的33% ～ 52.6%[8-13]。本例患兒存在復合雜合性突變，其中1個等位基因突變為c.1448T > C（p.L483P），驗證了c.1448T >?C（p.L483P）是中國人最常見的戈謝病突變類型的觀點，另一等位基因突變c.680_681delATinsGG（p.N227R）為罕見突變，尚未有研究對該突變進行致病性鑒定。根據ACMG/AMP指南，該變異分類為“致病性的”。除了c.680_681delATinsGG（p.N227R）突變外，p.227位置還存在另外3種不同的核苷酸變化，p.N227S （c.680A > G）、p.N227I （c.680A > T） 和p.N227K （c.681T > G）突變，表明c.680和c.681位點為突變熱點[19-20]。值得注意的是，Martínez-Arias 等[17]檢測了世界上多種人群的100條染色體，發現對應于GBA基因第227位密碼子（AAT）的后2個核苷酸（c.680-681，AT），GBAP基因的主要單體型為GG（占66%，與本例的突變型相同），次要單體型為AG（占34%）。作者認為，當在GBA基因中檢測到p.N227R 突變（即c.680_681delATinsGG），應考慮GBA與GBAP基因間是否存在重組。本文采用的PCR擴增方法為巢式PCR擴增，避免了GBAP基因的擴增，同時整個GBA基因序列未發現其他重組突變位點，排除了基因重組的可能[9，14]。

戈謝病的基因型與表型的相關性十分復雜。研究表明，部分基因型與臨床表型譜有一定的相關性，對判斷疾病的分型和預后具有一定的指導作用。比如c.1226A > G（p.N419S）突變與較溫和的表型相關，或能阻止患者出現神經系統損害。c.1226A > G雜合子個體僅僅表現為戈謝病Ⅰ型;純合子個體甚至無任何癥狀[4]。另一方面，c.1342G? > C （p.D448H） 突變與戈謝病Ⅲ型中的亞型有關，癥狀包括心臟瓣膜鈣化或纖維化、角膜混濁和腦積水等[21]。而c.1448T > C（p.L483P）突變與嚴重表型相關：純合子個體可表現為不同嚴重程度的神經型或嚴重的Ⅰ型;復合雜合子個體的表型與攜帶的另一等位基因有關，如重組突變RecNciI與嚴重表型相關，故c.1448T > C / RecNciI基因型與神經型戈謝病有關[8-10]。包括本文在內的2例基因型為c.680_681delATinsGG/c.1448T > C的患兒均為戈謝病Ⅱ型，表明c.680_681delATinsGG與嚴重表型相關[10]。盡管存在這些突變的特異臨床表型譜，但大多數突變可以出現在各種戈謝病類型中，而且相同基因型的戈謝病患者可表現出很強的臨床表型異質性。由于戈謝病為常染色體隱性遺傳病，大多數患者為復合雜合性突變，有些突變在特定的家系中可能是獨特的，因此，很難從基因型準確預測復合雜合子的表型。影響戈謝病表型的因素很多，包括環境因素、遺傳背景以及各種修飾基因等[22]。識別這些重要表型的影響因素有助于最終揭開基因型和表型之間的復雜關系，并將改善戈謝病的治療效果。

目前針對戈謝病的特異性治療包括酶替代療法、底物減少療法、造血干細胞移植、分子伴侶治療法、基因治療和納米囊泡等[23-24] 。其中戈謝病Ⅰ型和部分Ⅲ型有可用的藥物，但存在治療費用極其昂貴、需終生使用和部分患者存在免疫反應等缺點，戈謝病Ⅱ型尚無有效治療方法。因此，遺傳攜帶者的檢出、癥狀前診斷、產前診斷及胚胎種植前診斷，對于戈謝病的早期治療及防止戈謝病重癥患兒的出生有著極其重要的意義。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-07-22）

（本文編輯：洪悅民）