青海不同產地寬葉羌活抗菌活性的篩選及活性比較

李美雎，朱瑞娟，陳海娟，尚 軍

(青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810008)

羌活為傘形科羌活屬的寬葉羌活(Notopterygiumfranchetii)或羌活(Notopterygiumincisum)的干燥根莖和根。寬葉羌活藥性溫，微苦、辛，歸膀胱、腎經。具有祛風、散寒的功效，主治外感風寒、頭痛無汗、風寒濕痹、項強筋急、肩臂酸痛、癰疽瘡毒等癥。主產于四川、甘肅、青海、西藏、陜西、新疆、云南等地。寬葉羌活喜陰冷濕潤氣候，怕強光，生長于海拔2 000～4 000 m的林緣、灌叢下、溝谷草叢中。寬葉羌活的化學成分中主要有揮發油、香豆素及糖類、有機酸、氨基酸等[1～3]。文獻研究報道[4]，采用高效液相色譜測定羌活中羌活醇、異歐前胡素的含量和薄層鑒別色譜法鑒別中藥羌活中紫花前胡苷的方法，能夠有效地控制中藥羌活的質量。寬葉羌活的藥理學研究表明，寬葉羌活有明顯的抗菌、抗炎、鎮痛、解熱、抗氧化、抗心律失常、抗血栓形成、抗心肌缺血、促進腦循環等藥理作用[5～8]。文獻研究報道羌活提取物對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，并篩選出兩個抗菌活性成分鐮葉芹二醇(falcarindiol)和苯乙基阿魏酸酯(phenethylferulate)[9～13]。

本實驗結合體外抗菌試驗，篩選出羌活抗菌活性部位[14]，且以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產氣桿菌(Enterobacteraerogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、變形桿菌(Proteusvulgaris)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)評價不同產地寬葉羌活抗菌活性，以此為寬葉羌活抗菌活性藥物開發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與藥材來源 6種寬葉羌活藥材均采挖于青海省不同的地方，分別為互助北山、佑寧寺、果洛瑪可河、幫菜、軍功、湟中。藥材粉碎后過60目篩，密閉保存備用；陽性藥物青霉素鈉購買于中諾藥業(石家莊)有限公司；試驗用培養基購買于北京奧波星生物技術有限責任公司。

1.1.2 實驗試劑 乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純，超純水。

1.1.3 實驗菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)

產氣桿菌(Enterobacteraerogenes)

大腸埃希菌(Escherichiacoli)

變形桿菌(Proteusvulgaris)

陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)

糞腸球菌(CoprococcusHoldemanandMoore)

以上7株用于活性部位的篩選和抗菌活性比較的指示菌均購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，于零下20攝氏度冰箱凍存，實驗前3～4 h復活使用。

1.1.4 實驗儀器 電子天平METTLER TOLEDO (XP205 DeltaRange)；

電熱恒溫培養箱；

可調微量移液器(1 000 μL、200 μL、50μL)；

超聲波清洗器SB-5200TDT(功率300W，頻率40kHZ)；

高壓滅菌鍋、無菌操作臺、離心機。

1.2 方法

1.2.1 寬葉羌活提取物的制備 取寬葉羌活藥材粉末(過60目篩)50 g，置500 mL圓底燒瓶中，加入400 mL無水乙醇經超聲處理(功率300 W，頻率40 kHZ)回流提取2 h，共3次，過濾，合并提取液后濃縮獲得羌活粗提取物浸膏，加超純水打成混懸液，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(分析純)萃取，濃縮得寬葉羌活各提取物浸膏，將各提取物放于恒溫烘箱或干燥器內保存，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定各寬葉羌活提取物，加入1 mL二甲基亞砜超聲溶解，搖勻，精密量取0.2 mL置于10mL容量瓶中，加25%的二甲基亞砜定容至刻度，即得供試品溶液。

1.2.3 陽性對照藥溶液的制備 于青霉素鈉(80萬單位)瓶中注入4 mL25%的二甲基亞砜，溶解、搖勻，取1 mL溶液置于5 mL容量瓶中，用4 mL25%的二甲基亞砜溶液定容，即得青霉素鈉為5萬單位的對照品溶液。

1.2.4 菌懸液的配置 將保存的實驗菌種活化后，加入超純水輕輕刮下菌苔并按菌液與超純水1∶9的比率稀釋成104倍，即得菌懸液，備用。

1.2.5 抑菌活性考察

(1)給藥方案及分組

空白組加入240 μL25%二甲基亞砜溶液；陽性藥組加入240 μL5萬單位青霉素鈉；實驗組加入240 μL寬葉羌活不同部位供試品溶液。每組設3個平行組，重復3次。

(2)抑菌活性部位篩選及比較

在超凈工作臺上于無菌條件下，用牛津杯法(瓊脂孔洞法)考察培養基中羌活不同部位抗菌活性，于培養箱中培養16～18 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑并記錄數據，考察不同產地羌活抑菌活性。

1.2.6 數據處理 數據處理采用SPSS17.0進行方差分析，數據以x±s表示(此公式表示數值偏差平均數的變動范圍，其中x表示平均數，s表示方差)。

2 結果

由表1可知，寬葉羌活5個活性部位對糞腸球菌和大腸桿菌均表現出較強的抗菌效應，與空白對照組相比除了石油醚和水層對糞腸球菌抗菌效應差異不顯著外，其它部位差異有統計學意義(P<0.01)。與空白對照組相比除了正丁醇和水層對大腸肝菌抗菌效應差異不顯著外，其它部位差異有統計學意義(P<0.01)；且不同部位間的抗菌效應強弱不同，其中石油醚對糞球菌抑菌效應差異不顯著；水層部位對大腸桿菌抑菌效應差異不顯著；氯仿部位與其他4個部位相比，對兩種菌的抑菌效應均較強，故選取氯仿部位作為寬葉羌活抑菌活性部位。

表1 寬葉羌活不同部位的抑菌作用

由表2可知，不同產地寬葉羌活對受試菌均表現出一定的抗菌活性，軍功幫菜、湟中、互助佑寧寺產寬葉羌活與空白組相比均有統計學意義(P<0.05或0.01)；果洛軍功寬葉羌活對變形桿菌的抑菌效應無統計學意義，互助北山、果洛瑪可河產寬葉羌活對銅綠假單胞菌的抑菌效應無統計學意義，對其它菌的抑菌效應均具有統計學意義(P<0.05或0.01)。

表2 不同產地寬葉羌活抑菌作用比較

由表3可知，對陰溝腸桿菌抗菌效應最強的是瑪可河產寬葉羌活，與佑寧寺產寬葉羌活差異顯著(P<0.05)，與其他地區產寬葉羌活氯仿部位相比差異不顯著；對大腸桿菌抗菌效應最強的是佑寧寺產寬葉羌活，與軍功幫菜和果洛軍功產寬葉羌活差異不顯著，與其他地區產寬葉羌活相比差異均顯著(P<0.01)；對產氣桿菌抗菌效應最強的是果洛軍功產寬葉羌活，與其它產地差別不顯著；對變形桿菌抗菌效應最強的是瑪可河產寬葉羌活，與互助北山佑寧寺、軍功幫菜產寬葉羌活差異不顯著，與湟中、果洛軍功產寬葉羌活差異顯著(P<0.01)；對糞腸球菌抗菌效應最強的是瑪可河產寬葉羌活，與其它產地差別不顯著；對銅綠假單胞菌抗菌效應最強的是果洛軍功產寬葉羌活，與互助北山、瑪可河產寬葉羌活相比差異顯著(P<0.05)，與其它地區產寬葉羌活均無顯著性差異；對金黃色葡萄球菌抗菌效應最強的是幫菜產寬葉羌活，與湟中、瑪可河、果洛軍功產寬葉羌活差異不顯著，與其他產地寬葉羌活差異顯著(P<0.05或P<0.01)。

表3 不同產地寬葉羌活抑菌作用效應比較

3 討論

隨著青霉素和磺胺類藥物在臨床上的廣泛使用，各種感染性疾病得到治療，但是細菌對抗菌藥物產生耐藥性的問題也越來越明顯，嚴重威脅人體健康。中藥發展幾千年的實踐經驗證明有許多中藥都具有抗菌活性、且副作用小、很少產生耐藥性等特點。有研究報道，復方川紫方具有抗菌消炎、通絡止痛、行氣活血散瘀等功能，由川芎、紫草、羌活等十余味藥組成[15]。實驗結果表明：寬葉羌活不同部位抗菌效應氯仿部位是最好的，水層部位效果不明顯，說明寬葉羌活的抗菌效應對活性部位的選擇具有科學性。其中，瑪可河產寬葉羌活對陰溝腸桿菌、變形桿菌、糞腸球菌抗菌效應最強；佑寧寺產寬葉羌活對大腸桿菌抗菌效應最強；果洛軍功產寬葉羌活對產氣桿菌、銅綠假單胞菌抗菌效應最強；幫菜產寬葉羌活對金黃色葡萄球菌抗菌效應最強。且不同產地寬葉羌活對膽囊炎相關菌呈現出一個綜合性效應。

寬葉羌活氯仿活性部位具有廣譜抗菌效應，可作為寬葉羌活抗菌藥物開發物質基礎，但由于本實驗采用人體給藥最大劑量換算為體外給藥劑量，所以關于寬葉羌活氯仿活性部位量效關系還有待于進一步研究。