體外培養對小鼠囊胚的發育潛能及DNA損傷的影響研究

馬媛，楊洋，陳書強，王曉紅*

(1.中國人民解放軍空軍軍醫大學唐都醫院婦產科生殖醫學中心，西安 710038；2.西安市第四醫院生殖醫學中心，西安 710004)

輔助生殖技術(ART)是指以治療不孕不育癥為目的而采取的在體外操作配子及胚胎的治療手段或方法，主要包括胚胎體外培養、體外受精、胚胎冷凍解凍技術等。但是，由于體外環境和體內的生理環境具有極大的不同，目前體外條件仍無法完全模擬體內環境。況且，胚胎早期尚不具備屏障和保護功能。因此，體外培養環境會給配子及胚胎造成環境應激，影響胚胎的發育潛能。本課題組既往研究發現，胚胎體外培養可影響小鼠囊胚的發育，降低囊胚的著床率，影響后期胎鼠的宮內生長[1]。而造成囊胚發育及胚胎存活率下降的相關機制目前尚不明確。

在生命活動進行時，維持基因組穩定需要DNA精確的復制和遺傳。DNA的完整性是保障胚胎發育、胚胎種植甚至子代健康的基礎[2]。如果DNA遭受到內源性或外源性刺激，可引起DNA損傷，從而導致細胞凋亡，細胞周期阻滯以及DNA損傷修復等。其中，DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)對基因組完整性以及后續的細胞存活具有嚴重的影響[3]。既往研究顯示，ART中多個步驟會導致DNA損傷，進一步影響配子的質量、胚胎發育甚至胎兒發育[4-6]。故本研究從DNA損傷為出發點，研究體外培養環境對小鼠囊胚DSBs的影響，為體外培養技術影響囊胚發育的潛在機制研究提供思路與方向。

材料與方法

一、實驗動物

清潔級ICR小鼠購自西安交通大學醫學部實驗動物中心(批號：61001700003690)。雌鼠4～6周齡，雄鼠3～6月齡，普通小鼠飼料喂養。

二、主要試劑和儀器

1.試劑：胚胎培養采用KSOM培養液(Millipore，美國)，微量胚胎cDNA線性擴增使用REPLI-g WTA Single Cell Kit(Qiagen，德國)；熒光聚合酶鏈反應試劑盒購自日本Takara公司，γH2AX一抗為兔單克隆抗體(ab81299)購自英國Abcam公司，免疫熒光二抗為驢抗兔抗體(A21206)購自美國invitrogen公司，Hoechst 購自美國Sigma公司(Hoechst 33258 solution)。

2.儀器：實體解剖鏡(廈門，Motic)，CO2培養箱(Thermo，美國)，培養皿(35 mm)(Nunc，丹麥)，超凈臺(Labconco，美國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。

三、研究方法及分組

1.小鼠模型建立及胚胎收集：雌鼠隨機分配為兩組，每組各6例。(1)自然交配組(Natural conception組，NC組)：將發情雌鼠與雄鼠1∶1自然合籠，次日檢查陰栓，見栓即為交配成功，當日計為0.5 d，于3.5 d處死見栓雌鼠取雙側子宮，PBS沖洗獲得囊胚；(2)體外培養組(In vitro culture組，IVC組)：將發情雌鼠與雄鼠1∶1自然合籠，次日檢查陰栓，見栓當日處死見栓雌鼠，于輸卵管取受精卵，用0.3%透明質酸酶消化受精卵周圍顆粒細胞，然后將消化分離的受精卵多次沖洗，轉入KSOM溶液中培養，于培養的3.5 d收集囊胚期胚胎。最終每組各獲得囊胚60枚用于后續分析。

2.實時定量PCR檢測：選擇每組囊胚20枚進行微量胚胎cDNA線性擴增，嚴格按照說明書要求操作。根據實時定量PCR試劑盒說明配制反應體系，反應總體系為20 μl：SYBR Green 10 μl，PCR特異上、下游引物按1∶1混合后取1.5 μl，cDNA模板1.5 μl，滅菌蒸餾水7 μl。擴增條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個cycle；72℃ 2 min。以GAPDH為內參，進行PCR反應，引物序列來自PrimerBank，詳見表1、2。每次檢測設定3個復孔，每個樣本重復3次。以上在每個PCR循環的延伸期采集熒光信號，PCR反應完成后利用溫度梯度變性獲得溶解曲線供PCR產物定性分析。根據PCR擴增曲線，得到每個樣本的循環周期數(Cq值)，使用 2-ΔΔCt法計算各組中目的基因的表達情況。

表1 囊胚發育潛能相關基因引物序列

表2 DNA損傷相關基因引物序列

3.胚胎免疫熒光檢測及分析：采用免疫熒光法檢測每個囊胚γH2AX的表達情況，從而分析其DNA損傷的程度。以下每兩個操作步驟之間均需用含有0.1%聚乙烯醇(PVA)的PBS洗滌囊胚3次。收集兩組囊胚各40例，4%多聚甲醛室溫固定2 h，加入0.2%Triton-X打孔30 min，封閉液室溫封閉2 h，加入一抗(1∶2 000稀釋)4℃孵育過夜；次日，將囊胚加入488標記的抗兔熒光二抗(1∶500稀釋)，避光孵育2 h，用含有10 μg/ml Hoechst 的PBS室溫避光染核30 min，PBS洗滌干凈后，封片，熒光顯微鏡照相。熒光亮度采用軟件Image J進行分析，選取目標區域，分析該區域平均光密度水平，并計算出同一樣本Hoechst染核的平均光密度。γH2AX的平均光密度值與核的平均光密度值的比值即為本樣品的實際平均光密度值。

四、統計學分析

結 果

一、體外培養對囊胚早期發育的影響

通過對囊胚中多能因子和早期細胞定向分化因子的表達分析發現，與NC組比較，IVC組的多能因子Pou5f1、Nanog基因表達下降(P<0.05)，滋養層細胞分化相關分子Tead4的基因表達上調(P<0.05)，滋養層細胞分化相關分子Cdx2、Eomes和Elf5的基因表達均顯著下降(P<0.05)，調控原始外胚層分化的基因Gata6、Sox17、Fgfr2以及Fgfr4在IVC組表達下降(P<0.05)。與NC組比較，IVC組中Lif基因也顯著下降(P<0.05)(表3)。

表3 兩組囊胚中發育潛能基因表達比較(-±s)

二、體外培養對囊胚DNA損傷的影響

與NC組的γH2AX相對熒光密度(0.558±0.560)比較，IVC組的γH2AX相對熒光密度(0.614±0.092)顯著升高(P<0.05)(圖1、2)。

γH2AX：γH2AX染色；Hoechst：細胞核染色；Merge：γH2AX與Hoechst重合后的顯像圖1 兩組囊胚免疫熒光檢測圖像(×200)

注：與NC組比較，*P<0.05圖2 體外培養對囊胚中γH2AX表達的影響

三、體外培養對囊胚DNA損傷相關基因表達的影響

與NC組比較，IVC組的DNA損傷相關基因Fas、Gadd45a和Ddit3的表達顯著上升(P<0.05)(表4)。

表4 體外培養對囊胚DNA損傷相關基因表達的影響(-±s)

討 論

在胚胎發育早期，一些影響胚胎生長發育及分化的調控基因的突變，可以導致胚胎發育異常，決定胚胎的命運。本研究發現，體外培養環境可影響小鼠囊胚多個命運決定因子的表達。這些因子中，Pou5f1、Nanog和Sox2可以維持囊胚內細胞團細胞的多能性，使小鼠囊胚內細胞團進一步分化成上胚層和原始內胚層[7]；而Cdx2、Eomes和Elf5可調控囊胚分化。Cdx2有利于保持囊胚期外滋養層細胞的完整性[8]。Eomes參與滋養層細胞的命運走向，當敲除Eomes基因后，胚胎可以發育成形態看似正常但發育停滯的囊胚[9]。Elf5可進一步加強Cdx2和Eomes的轉錄[10]。Gata4、Gata6、Sox17以及Fgfr2和Fgfr4是外滋養層細胞特異性轉錄因子，可以調控原始外胚層的分化[11]。Tead4定位于原始外胚層中的線粒體，主要作用于原始外胚層中代謝的建立[12]。另外多分化因子Lif可以支持卵裂期細胞和囊胚發育，促進胚胎著床[13]。本研究發現，IVC組的多能因子、滋養層細胞分化相關基因、原始外胚層分化調控基因等多個囊胚命運決定因子的基因表達發生顯著改變；既往研究表明，對山羊和貓的胚胎進行體外培養，也出現了早期胚胎命運決定因子的變化[14-15]。以上研究提示，單純體外培養環境即可影響囊胚的早期命運。

DNA的精確復制和遺傳對維持基因組穩定具有重要作用。如果早期胚胎在DNA復制和遺傳過程中發生損傷，可能影響胚胎及子代發育。既往有研究提示ART技術可導致DNA損傷[2，4，6]。與ART相關的DNA損傷是影響配子質量和胚胎發育的重要因素[16]。體外培養技術是ART中重要的組成部分，故本研究進一步對經過體外培養的小鼠囊胚DNA損傷及相關損傷修復因子的表達進行分析。

H2AX是哺乳動物細胞中核心組蛋白H2A的亞型，當發生DSB時，H2AX蛋白發生磷酸化形成γH2AX。因此，對γH2AX的識別成為檢測DSBs的理想手段[3]。本研究中采用免疫熒光法對兩組胚胎中γ-H2AX的表達進行分析從而間接顯示兩組胚胎DNA的損傷程度，結果顯示IVC組γH2AX相對熒光密度顯著升高。以上結果提示，體外培養可導致囊胚中DNA雙鏈斷裂損傷的發生風險增加。在DSBs過程中，一些因子可在細胞凋亡、染色質重排、DNA修復等過程中發揮作用。Gadd45a參與細胞周期調控、DNA損傷修復、細胞凋亡及信號轉導等過程[17]。Fas系統是死亡受體信號轉導途徑的重要凋亡途徑之一，Casp3是Fas介導細胞凋亡信號傳導通路中的核心蛋白，是細胞凋亡性死亡的最終執行者[18]。Ddit3參與內質網應激參與的凋亡通路[19]。經過對比發現，與NC組相比，IVC組的DNA損傷相關基因Fas、Gadd45a和Ddit3的表達顯著上升。提示體外培養環境可在導致DNA雙鏈斷裂損傷，并在多個方面發揮作用，可能誘導細胞凋亡和染色質重排，最終影響囊胚的發育。

關于ART技術導致DNA損傷的研究發現，體外受精-胚胎移植的小鼠胎兒腦組織中DNA損傷修復基因表達顯著改變[6]，玻璃化冷凍技術可以導致小鼠卵母細胞DNA損傷加劇[4]。以上研究包括本項研究均提示ART技術與DNA損傷具有密切關系，關于其對后續胎鼠發育的影響仍需要進一步研究。

綜上，本研究結果顯示，體外培養可導致小鼠囊胚多能因子及早期胚胎命運決定基因表達水平發生改變，影響小鼠囊胚發育潛能。這與IVC組小鼠囊胚DNA損傷增加、DNA損傷相關基因的表達異常具有潛在聯系。