苗藥血人參及其復方制劑對“免疫低下”模型小鼠的影響

許 歡 張永萍,2* 段 麗

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；3.國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550025

血人參是豆科蝶形花亞科植物茸毛木藍IndigoferastaclrvoidesLindl.的根，是貴州苗族常用藥，在2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》中有收載，又名雪人參，《貴州民間方藥集》中稱為鐵刷子，《云南中草藥》中稱其為紅苦刺、山紅花。血人參主要分布在云南、貴州、四川、廣西等地，特別在貴州貴陽、安順、黔東南等地分布較為廣泛。血人參植物主要含有揮發油、黃烷醇、甾醇體類等活性化學成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝、抗癌、抑菌、抗病毒等作用[1-4]。血人參性溫，味微苦澀，有補氣攝血、滋陰補腎之功效，主治崩漏、跌打、風濕、肝硬化、痢疾及疳積等[5]。芪膠升白膠囊是貴州苗藥制劑之一，由大棗、阿膠、血人參、淫羊藿等中藥組成，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗疲勞、抗病毒等作用，用于白血病、癌癥、腫瘤的治療[6]。免疫力是機體自身的防御能力，可抵御外界細菌、病毒對機體的攻擊。免疫低下表現為機體功能的不足，是苗醫理論中冷病的一種，而建立免疫低下模型是評價藥物增強免疫作用的前提。偏最小二乘回歸(Partial least-squaresregression，PLS)是一種新型的多元統計數據分析方法，主要用來解決多元回歸分析中的變量多重相關性或解釋變量多于樣本點等實際問題，其理論研究進展非常迅速，應用不斷擴展，涉及醫學、藥物學等領域。本研究通過監測環磷酰胺不同用藥劑量和用藥周期對模型小鼠體重、小鼠臟器指數、血常規等指標影響變化，采用SIMCA-P軟件的偏最小二乘法回歸(PLS)進行數據統計建模分析，通過PLS分析方法對免疫抑制模型進行綜合評價，進而確定建立小鼠免疫抑制的最佳條件，為建立穩定的免疫力低下的動物模型提供實驗依據。通過建立免疫低下模型，評價苗藥血人參及其制劑芪膠升白膠囊對免疫抑制小鼠身體機能的作用，為苗藥血人參的開發利用及芪膠升白膠囊新功能新用途的發現奠定一定實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 藥品及試劑 血人參(批號：160211，貴州德昌祥藥業有限公司)；血人參乙酸乙酯部位(實驗室自制)；注射用環磷酰胺(批號：16070925，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；氯化鈉注射液(批號：E116080908，貴州科倫藥業有限公司)；氯化鈉注射液(批號：E116020302，貴州科倫藥業有限公司)；苦味酸(批號：130901，西隴化工股份有限公司)；羧甲基纖維素鈉(批號：20160412，天津市福晨化學試劑廠)；芪膠升白膠囊(批號：25270051，貴州德昌祥藥業有限公司)。

1.2 動物 SPF級KM小鼠，雄性，體重(18～22)g，購自重慶騰鑫實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)2012-0011。室溫(24±2)℃，相對濕度40%～60%，晝夜光照節律12 h∶12 h，自由飲水，飼固體飼料，適應性喂養7 d后進行試驗。

1.3 儀器 AE/240型電子天平(上海梅特勒儀器有限公司)；BC-5380血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；JJ223BC電子分析天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；EDTAK2一次性使用人體靜脈血樣采集器(瀏陽市三力醫用科技發展有限公司)。

2 方法

2.1 “免疫低下”動物模型的復制

2.1.1 動物分組 小鼠適應性飼喂養7 d后隨機分成正常組、5個模型組(模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組)，每組8只。

2.1.2 動物造模 參照相關文獻[7-11]的基礎上，環磷酰胺干粉用生理鹽水稀釋配成10 mg/mL濃度的環磷酰胺溶液，現用現配。采用腹腔注射，正常組每日注射生理鹽水，模型Ⅰ組，連續腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg，共6 d；模型Ⅱ組，按照40 mg/kg的劑量隔日注射環磷酰胺溶液，首次80 mg/kg，共4次；模型Ⅲ組，連續腹腔注射環磷酰胺80 mg/kg，共6次；模型Ⅳ組腹腔注射100 mg/kg環磷酰胺造成免疫力低下模型，1次/d，連續6 d；模型Ⅴ組每天腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg，連續6 d，各組動物注射完成后常規飼養至10 d。

2.1.3 指標檢測 造模過程中每天測量并記錄各組小鼠體重，觀察飲水、飲食狀況。動物處死前先稱體重，稱量臟器(胸腺、脾臟)重量，計算臟器指數(臟器指數=臟器重量/體重)。動物處死前摘眼球取血，用EDTA-K2抗凝管抗凝，做血常規分析。

2.2 苗藥血人參及其復方制劑對“免疫低下”模型小鼠的作用

2.2.1 藥品的配制 環磷酰胺注射液的配制：取環磷酰胺無菌注射粉末于十萬分之一天平稱重，用生理鹽水配成10 mg/mL，現配現用。芪膠升白膠囊溶液的配制：取芪膠升白膠囊取膠囊內容物，萬分之一天平稱重后，用0.25%羧甲基纖維素鈉配成2.00、1.00、0.50 g/mL，4 ℃保存備用；血人參乙酸乙酯部位溶液的配制：取血人參乙酸乙酯部位加水配制成0.32、0.16、0.08 g/mL 4 ℃保存備用。

2.2.2 動物造模 參照文獻[8-9]及前期實驗基礎上，采用造模與給藥同時進行的方式，各組小鼠連續灌胃20 d，除正常組每天給生理鹽水外，其余各組以100 mg/kg的劑量腹腔注射環磷酰胺構建免疫力低下模型，1次/d，連續6 d，同時給予相應濃度的血人參乙酸乙酯部位藥液和芪膠升白膠囊藥液治療。

2.2.3 分組與給藥 將小鼠隨機分為正常組，模型組，血人參高、中、低劑量組(劑量分別為：0.32、0.16、0.08 g/kg)、芪膠升白膠囊高、中、低劑量組(劑量分別為：2.00、1.00、0.50 g/kg)，每組10只。給藥體積均為0.1 mL/10 g，連續給藥20 d。

2.2.4 檢測指標 第20天給藥后，禁食不禁水12 h，稱重后，摘眼球取血，集滿1 mL左右血液后，用脫臼法處死小鼠，取胸腺、脾臟器稱重，計算臟器指數。脾指數=脾重(mg)/體重(g)，胸腺指數=胸腺重(mg)/體重(g)。用血細胞分析儀測量各組小鼠白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板數量、淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比、血紅蛋白量。

3 結果

3.1 環磷酰胺對小鼠體重的影響 由表1可見，與正常組相比，模型組小鼠的終體重都降低，除模型Ⅱ組外差異具有統計學意義(P<0.05)。

表1 小鼠終體重的比較

3.2 環磷酰胺對小鼠免疫器官指數的影響 從表2可見，環磷酰胺引起小鼠胸腺和脾臟變化，模型組Ⅱ小鼠的胸腺指數較正常組減小(P<0.01)；模型組脾指數增大，其中模型Ⅱ和模型Ⅲ組差異尤其明顯(P<0.01)，模型Ⅳ差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 環磷酰胺對模型小鼠免疫器官指數的影響

3.3 環磷酰胺對小鼠血液學指標的影響 由表3可見，與正常組相比，模型Ⅰ組小鼠的紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、紅細胞分部寬度均有不同程度的降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；模型Ⅱ組小鼠紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、紅細胞分均有不同程度的降低且差異具有統計學意義(P<0.01)；模型Ⅲ組小鼠白細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、平均血紅蛋白濃度、血小板、平均血小板體積、血小板積壓變化差異有統計學意義(P<0.01)，紅細胞分部寬度升高且差異有統計學意義(P<0.05)；模型Ⅳ組小鼠白細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、平均血紅蛋白濃度、紅細胞分部寬度、血小板、平均血小板體積、血小板積壓變化差異有高度統計學意義(P<0.01)；模型Ⅴ組小鼠紅細胞、紅細胞分部寬度變化差異有高度統計學意義(P<0.01)，血紅蛋白、紅細胞壓積、平均血小板體積變化差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 環磷酰胺對模型小鼠血液學指標的影響

3.4 采用偏最小二乘法 (PLS)對各組藥效綜合分析

3.4.1 對6個組的檢測指標進行標準化處理 對本實驗6個組的檢測指標進行標準化處理，自變量表見表4。

表4 自變量表

3.4.2 VIP變量投影重要性指標 VIP變量投影重要性指標用來描述自變量對因變量的解釋能力，VIP值越大，自變量x對y的解釋能力越強。各組小鼠綜合藥效得分表。見表5。

表5 各組小鼠綜合藥效得分表

3.4.3 各組小鼠綜合藥效得分比較圖 采用SIMCA-P軟件的偏最小二乘法回歸(PLS)對模型小鼠的終體重、臟器指數、血常規等指標進行數據統計建模分析，結果如圖1所示，模型組較正常組差異均有顯著性，其中模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組差異都有顯著性，其中模型Ⅳ明顯是較佳的造模方法。

圖1 各組小鼠綜合藥效得分比較圖

3.5 對免疫抑制小鼠體重的影響 與正常組比較，各組小鼠給藥第1天，體重無明顯差異，給藥第3天體重下降，具有高度統計學差異(P<0.01)；與模型組相比，實驗第13天，血人參乙酸乙酯部位高中低劑量組體重增加，無統計學差異(P>0.05)，說明血人參乙酸乙酯部位高、中劑量對環磷酰胺致小鼠體重下降有一定的抑制作用；實驗第19天，芪膠升白膠囊2.00、1.00 g/kg劑量組體重增加，有統計學差異(P<0.05)，說明芪膠升白膠囊2.00、1.00 g/kg劑量對環磷酰胺致小鼠體重下降有一定的抑制作用。結果見表6。

表6 免疫抑制小鼠體重的比較

3.6 對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響 由表7 可知，與正常組比較，血人參乙酸乙酯部位各劑量能降低小鼠脾指數，但無統計學差異；與模型組比較，血人參乙酸乙酯部位低劑量組能升高小鼠脾指數，但無統計學差異。與正常組比較，血人參乙酸乙酯部位各劑量組使小鼠胸腺指數升高，但無統計學差異；與模型組比較，血人參乙酸乙酯部位各組均能明顯升高免疫抑制小鼠胸腺指數，血人參乙酸乙酯部位高劑量組能升高小鼠脾指數，且有統計學差異(P<0.05)；血人參乙酸乙酯部位中劑量組能升高小鼠胸腺指數，具有高度統計學差異(P<0.01)。以上結果表明血人參乙酸乙酯部位高中低劑量組均可升高免疫抑制小鼠的胸腺指數，但對其脾指數影響不大。

由表7可見，與正常組比較，芪膠升白膠囊高劑量組能升高小鼠脾指數，但無統計學差異；與模型組比較，芪膠升白膠囊高、中劑量組能升高小鼠脾指數，但無統計學差異。與正常組比較，芪膠升白膠囊各劑量組均能升高小鼠的胸腺指數；與模型組比較，芪膠升白膠囊各組均能明顯升高免疫抑制小鼠胸腺指數，但無統計學差異。以上結果表明芪膠升白膠囊高、中、低劑量組可明顯升高免疫抑制小鼠的胸腺指數，但對其脾指數影響不大。

表7 小鼠脾指數、胸腺指數的比較

3.7 對免疫抑制小鼠血常規的影響 由表8 可知，與正常組比較，實驗各組的白細胞數量減少，且具有高度統計學差異(P<0.01)，紅細胞數量、血紅蛋白量均減少，但無統計學差異；血人參乙酸乙酯部位高劑量組血小板數量增加，有高度統計學差異(P<0.05)，血人參中劑量組血小板數量增加，有高度統計學差異(P<0.01)，說明用環磷酰胺致白細胞減少型免疫抑制型模型成功，可以用來評價藥物升高白細胞增強免疫的動物模型。與模型組相比，血人參乙酸乙酯部位高、中劑量組的白細胞、紅細胞數、血紅蛋白數量稍有升高，但無統計學差異；血人參乙酸乙酯部位各劑量組小鼠的血小板數量均升高，有統計學差異(P<0.01)；血人參低劑量組的白細胞、紅細胞數、血紅蛋白數量降低，但無統計學差異，說明血人參乙酸乙酯部位對環磷酰胺致小鼠免疫抑制有一定抑制作用。

由表8可知，與正常組比較，環磷酰胺組的白細胞數量減少，且具有高度統計學差異(P<0.01)，紅細胞數量、血小板數量、血紅蛋白量均減少，但無統計學差異，說明用環磷酰胺致白細胞減少型免疫抑制型模型成功，可以用來評價藥物升高白細胞增強免疫的動物模型。與模型組相比，芪膠升白膠囊高、低劑量組的白細胞、紅細胞數、血小板數、血紅蛋白數量稍有升高，但無統計學差異；芪膠升白膠囊中劑量組的白細胞、血小板數量升高，但無統計學差異，說明芪膠升白膠囊對環磷酰胺致小鼠免疫抑制有一定抑制作用。

表8 小鼠血常規的比較

4 討論

免疫低下是指機體免疫系統由于先天性發育不良或后天遭受損害所致的免疫功能降低或缺乏[12]，機體免疫低下時，易于感染或發生免疫性疾病等免疫功能異常的表現[13]。環磷酰胺，為烷化劑類抗腫瘤藥，科研試驗中也采用環磷酰胺構建免疫低下模型[14-17]、免疫抑制模型[18]等。環磷酰胺為免疫抑制劑，惡性腫瘤患者服用該藥后出現的一系列不良反應，如少氣懶言、神疲倦乏、乏力自汗、心悸失眠、記憶減退、腰膝酸軟、惡心嘔吐等癥狀，皆屬于免疫功能降低的表現。血液中的各種白細胞如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞及血漿中的各種抗體和補體時機體免疫細胞和免疫分子中的成分，在機體的免疫防御系統中起著重要作用。紅細胞也與機體免疫反應有關，紅細胞表面有補體受體，能黏附免疫復合物，將其帶到肝和脾臟使免疫復合物被巨噬細胞吞噬，從而能清除病理性循環免疫復合物。因此，本實驗通過檢測小鼠血常規中的白細胞、紅細胞、血小板、血紅蛋白的數量來評價血人參對環磷酰胺致小鼠免疫功能降低的抑制作用。

芪膠升白膠囊是根據少數民族苗族民間驗方，選用名貴地道藥材，運用現代科學方法，提煉精制而成的純中藥制劑，芪膠升白膠囊具有益氣生血、補血益髓、溫補腎陽的作用[19-20]。實驗結果顯示，非特異性免疫方面：芪膠升白膠囊能明顯升高免疫抑制小鼠胸腺指數，提示其增強正常小鼠機體免疫功能可能與免疫器官無直接聯系，但芪膠升白膠囊增強免疫抑制小鼠免疫功能可能與胸腺有密切聯系，為芪膠升白膠囊有待發展成為免疫調節的輔助用藥提供理論參考，同時也為臨床推廣應用提供一定的實驗依據。芪膠升白膠囊是貴州民間傳統苗藥驗方中成藥產品，其增強機體免疫功能的作用是單一成分起作用還是多種成分起作用，有待進一步研究。芪膠升白膠囊具有升高白細胞、提高免疫抑制小鼠胸腺指數的作用，可以為其臨床應用提供實驗基礎，增強了該藥在臨床應用的安全性、合理性和科學性。芪膠升白膠囊處方的重要組成成分血人參具有滋陰補虛、調經攝血、活血舒筋的功效，研究發現其乙酸乙酯部位具有增加血小板數量、提高免疫抑制小鼠胸腺指數的作用，然而其升高機體血小板數量的作用是單一成分起作用還是多種成分起作用，有待進一步研究。