溫腎育卵湯對PCOS模型大鼠卵巢ERα、ERβ表達的影響*

周 鷺，蔣涵穎，滕紅麗

（1.湖北民族大學醫學部，湖北 恩施 445000；2.廣西國際壯族醫院，廣西 南寧 530001）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是臨床常見的內分泌代謝紊亂疾病，發病率達6%~10%[1]，占不孕人群的30%~40%，主要由神經、內分泌及代謝系統和卵巢局部調節因子失衡引起，其主要表現為持續性無排卵和卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥、胰島素抵抗等，其發病具有多因性，與遺傳、環境、飲食、生活方式、精神心理等因素密切相關[2-3]。雌激素在生殖系統的發育中起著重要作用，而雌激素作用的主要介體是雌激素受體（Estrogen Receptor，ER），主要分為兩類——雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ），都是下丘腦-垂體-卵巢軸正常運作所必需的受體[4]。ER異常的表達對生殖健康產生了重要影響。PCOS病因的復雜性和表現的多樣性使其治療成為難題，積極探索中醫藥治療方法具有重要意義。溫腎育卵湯是國醫大師治療排卵障礙的經驗方，應用于臨床多年，療效顯著。本研究基于PCOS模型大鼠，探討溫腎育卵湯對大鼠卵巢ERα和ERβ的蛋白和基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6周齡SPF級雌性SD大鼠54只，體質量180~200 g，購自于長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0014。常規顆粒飼料喂養，自由食水，12 h晝夜節律。環境溫度24～26℃，濕度40%～70%。適應性喂養1周后開始實驗。本實驗經醫學實驗動物管理委員會批準，于廣西中醫藥大學方藥重點實驗室進行，實驗過程完全符合動物實驗倫理規范要求。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 藥物 溫腎育卵湯，方藥組成：當歸身9 g，鹿角霜20 g，仙茅9 g，菟絲子20 g，巴戟天15 g，紫石英30 g，熟地黃15 g，黨參15 g，白術15 g，蛇床子3 g，艾葉5 g，小茴香2 g，花椒2 g，炙甘草10 g，由廣西中醫藥大學附屬醫院提供。根據動物和人體等效劑量換算公式及換算系數0.162[5]，按成人（60 kg）為標準體質量，換算成大鼠（100 g為標準）每天給藥的高劑量為3.5 g。水煎液制備方法：稱取340 g溫腎育卵湯藥材，以適量清水浸泡1 h，然后用大火將其煮沸，小火維持沸騰狀態30 min，分離藥液，重新向鍋中加入清水，繼續以上方法煎煮3次，收集3次煎煮的藥液，混勻，置于不銹鋼鍋中，濃縮藥液至97.1 mL，得到濃度為3.5 g/mL的溶液，此濃度為溫腎育卵湯高劑量組，保存在4℃冰箱中備用。來曲唑片（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號：H19991001，規格：2.5 mg/片）；枸櫞酸氯米芬片（塞浦路斯高特制藥有限公司，批號：H20140688，規格：50 mg/片），將枸櫞酸氯米芬片溶于蒸餾水，制成0.45 mg/mL水溶液備用。

1.2.2 試劑ERα抗體（批號：GTX22746）、ERβ抗體（批號：GTX23577）（欣博盛生物科技有限公司）；ERα一抗（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：Ab3574）；ERβ一抗（上海艾博抗貿易有限公司，批號：PAB33378）；MaxVision TM HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，批號：KIT-5020）。

1.3 主要儀器DM1000型普通正置顯微鏡（德國徠卡顯微系統有限公司）；1658033型垂直電泳儀（美國BIO-RAD公司）；AR224CN型電子分析天平（上海奧豪斯儀有限公司）；Light Cycler 96型全自動實時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏診斷產品有限公司）；Multiskan GO型全波長酶標儀（中國賽默飛世爾科技有限公司）。

1.4 PCOS動物模型建立與分組 利用來曲唑法建立PCOS模型[6-8]，取46只大鼠灌胃1%來曲唑羧甲基纖維素溶液[8mL/（kg·d），0.125 mg/mL]，1次/d，連續給藥21 d，其余8只大鼠作為正常組，每日給等體積羧甲基纖維素溶液灌胃。造模第7天開始，每天10:00:00進行陰道涂片，觀察上皮細胞形態改變，監測大鼠動情周期。連續陰道涂片檢查2個周期，大鼠失去規律的動情周期作為建立模型成功。選取造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、枸櫞酸氯米芬片組、溫腎育卵湯高劑量組、溫腎育卵湯中劑量組、溫腎育卵湯低劑量組，每組8只。

1.5 實驗給藥 自造模第22天開始給藥，枸櫞酸氯米芬片組大鼠按4.5 mg/（kg·d）灌胃枸櫞酸氯米芬片溶液；溫腎育卵湯低、中、高劑量組大鼠分別給予低、中、高劑量[8.75、17.50、35.00 g/（kg·d）]溫腎育卵湯灌胃，正常組和模型組大鼠相同條件下灌胃等體積蒸餾水，1次/d，連續給藥21 d。末次給藥后禁食12 h以上，稱量大鼠體質量后用10%水合氯醛經腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g），剖開腹腔充分暴露大鼠子宮及附件，將卵巢組織取出，一側卵巢置4%多聚甲醛中固定，以供病理學和免疫組化檢測，另一側置EP管后放入-80℃冰箱以供Western blotting、RT-PCR檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 形態學觀察 每日觀察造模前后大鼠進食、進水量、活動量及毛發狀態，自造模開始每周記錄一次體質量。

1.6.2 卵巢組織病理學檢查 將固定于4%多聚甲醛中的卵巢送至武漢華聯科生物技術有限公司進行石蠟包埋切片，HE染色后通過顯微鏡拍照，Leica Application Suite圖像系統采集卵巢組織形態及卵泡發育狀況。

1.6.3 免疫組化檢測各組大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白表達量 由武漢華聯科生物技術有限公司對卵巢組織石蠟切片后，免疫組化檢測大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白的表達情況。通過顯微鏡拍照，采集圖像，DAB顯出陽性為棕黃色。通過Image-Pro plus6.0圖像軟件對ERα、ERβ蛋白表達量進行分析，計算平均光密度值。

1.6.4 RT-PCR檢測各組大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA相對表達量RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司根據GenBank中所查的mRNA序列設計并合成，序列見表1。用TRNzol法提取卵巢組織的總RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA的濃度后按照逆轉錄試劑盒步驟將總RNA逆轉錄為cDNA。PCR反應條件：預變性：95℃，3 min，1次循環；變性：95℃，10 s，退火：60℃，30 s，40次循環。以GAPDH為內參，計算各組大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA相對表達量。

表1 引物序列表

1.6.5 Western blotting檢測各組大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白相對表達量 取出適量組織加入裂解液后在低溫研磨機上進行研磨，充分裂解后于4℃10 000 r/min離心10 min，取上清液用酶標儀測蛋白濃度，蛋白定量后100℃加熱5 min，變性后-20℃保存。每孔以10 μL總量上樣到預制膠，140 V電泳約50 min后，250 mA電轉2 h，轉膜后一抗（1:1 000）4℃孵育過夜，常溫孵育二抗ERα（1:500）、ERβ（1:1 000）2 h后顯影。用Image J檢測灰度值，最終結果以目標蛋白與GAPDH的比值表示ERα、ERβ蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法 通過SPSS 26.0軟件進行統計學分析，計量資料均以“均數±標準差”（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況觀察 給藥前，正常組大鼠活動積極，體型適中，進食、進水量正常，毛發光澤、干凈；其余各組大鼠活動量明顯減少，體型肥胖，毛發旺盛且雜亂，光澤度低，進食、進水量與正常組無明顯區別。給藥后，與模型組比較，枸櫞酸氯米芬片組和溫腎育卵湯低劑量組大鼠活動量稍增，毛發和體型狀況無明顯差別；溫腎育卵湯中、高劑量組大鼠活動量增加，毛發更有光澤。

給藥前各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥后溫腎育卵湯中、高劑量組大鼠體質量明顯低于給藥前（P＜0.05），其余各組給藥前后體質量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠給藥前后體質量比較（±s，g）

表2 各組大鼠給藥前后體質量比較（±s，g）

注：與給藥前比較，aP＜0.05，bP＞0.05

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2.2 各組大鼠卵巢組織形態學變化HE染色顯示正常組大鼠卵巢可見原始卵泡、成熟卵泡等大小不一的各級卵泡，層次結構清晰，顆粒細胞層次較多且排列整齊，并可見數個黃體；模型組大鼠卵巢可見多個囊狀卵泡和閉鎖卵泡，顆粒細胞層明顯減少且排列雜亂，未見黃體；枸櫞酸氯米芬片組大鼠卵巢顆粒細胞較模型組明顯增多，可見少量原始卵泡，偶爾可見囊狀卵泡和黃體；溫腎育卵湯低劑量組大鼠卵巢較模型組顆粒細胞增多，偶爾可見少量原始卵泡，未見黃體；溫腎育卵湯中劑量組大鼠卵巢可見大量原始卵泡，顆粒細胞較多，排列雜亂，偶見少量囊狀卵泡；溫腎育卵湯高劑量組大鼠卵巢可見大量原始卵泡和黃體，顆粒細胞較多且排列整齊，偶見成熟卵泡。（見圖1）

圖1 各組大鼠卵巢組織形態比較（HE，×200）

2.3 各組大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白表達情況 免疫組化蛋白表達陽性顯色為棕黃色。正常組大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白陽性表達最高，模型組最低。與模型組比較，枸櫞酸氯米芬片組和溫腎育卵湯低、中、高劑量組大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白陽性表達面積呈現不同程度的上升。（見圖2）

圖2 各組大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白表達情況（免疫組化，×200）

模型組大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白表達水平明顯低于正常組（P＜0.01）；枸櫞酸氯米芬片組和溫腎育卵湯低、中、高劑量組大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白表達水平明顯高于模型組（P＜0.01）；溫腎育卵湯低劑量組大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白表達水平明顯低于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01）；溫腎育卵湯中劑量組大鼠卵巢中ERα蛋白表達水平明顯低于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01），ERβ蛋白表達水平明顯高于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01）；溫腎育卵湯高劑量組大鼠卵巢中ERβ蛋白表達水平低于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01），而ERα蛋白表達水平與枸櫞酸氯米芬片組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠卵巢中ERα和ERβ蛋白的光密度值比較（±s）

表3 各組大鼠卵巢中ERα和ERβ蛋白的光密度值比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與枸櫞酸氯米芬片組比較，cP＜0.01

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2.4 各組大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相對表達量比較 模型組大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相對表達量明顯低于正常組（P＜0.01）；枸櫞酸氯米芬片組和溫腎育卵湯低、中、高劑量組大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相對表達量明顯高于模型組（P＜0.01）；溫腎育卵湯低、中劑量組大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相對表達量明顯低于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01）；溫腎育卵湯高劑量組大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相對表達量明顯高于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01）。（見表4）

表4 各組大鼠卵巢中ERα、ERβ基因表達量比較（±s）

表4 各組大鼠卵巢中ERα、ERβ基因表達量比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與枸櫞酸氯米芬片組比較，cP＜0.01

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2.5 各組大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白相對表達量比較 模型組大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白相對表達量明顯低于正常組（P＜0.01）；枸櫞酸氯米芬片組和溫腎育卵湯中、高劑量組大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白相對表達量明顯高于模型組（P＜0.01），溫腎育卵湯低劑量組大鼠卵巢中ERβ蛋白相對表達量明顯高于模型組（P＜0.01），而ERα蛋白相對表達量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；溫腎育卵湯低劑量組大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白相對表達量明顯低于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01）；溫腎育卵湯中劑量組大鼠卵巢中ERα蛋白相對表達量明顯低于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01），而ERβ蛋白相對表達量明顯高于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01）；溫腎育卵湯高劑量組大鼠卵巢中ERα蛋白相對表達量明顯高于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01），而ERβ蛋白相對表達量明顯低于枸櫞酸氯米芬片組（P＜0.01）。（見圖3、表5）

圖3 各組大鼠卵巢組織中ERα、ERβ蛋白表達圖

表5 各組大鼠卵巢組織中ERα、ERβ蛋白相對表達量比較（±s）

表5 各組大鼠卵巢組織中ERα、ERβ蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與枸櫞酸氯米芬片組比較，cP＜0.01

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3 討 論

PCOS的病因復雜且尚不明確，可能為下丘腦-垂體-卵巢軸出現調節功能障礙，從而導致ERα和ERβ基因和蛋白的表達異常。雌激素通過ERα調節周期促性腺激素的釋放[9]，ERβ的激活可促進卵泡的發生和排卵[10]。研究顯示ER基因的敲除可導致卵泡發育異常、早期閉鎖卵泡[11-12]，當人體內ER缺乏時，卵巢組織功能會受到嚴重損傷，可能會導致患者受孕率降低和流產[13-14]。恢復ER的表達有助于改善排卵狀況，減少PCOS相關不孕癥的發生[15-16]。

班秀文是我國首屆國醫大師，從事中醫、壯醫教學，臨床醫療和科研工作五十余年，臨床尤其擅長治療婦科疾病。對于不孕癥的認識，班老認為“月經不調之婦，鮮有能受孕者”[17]。故對不孕癥的治療，班老首先著眼于調理經候，后人總結為“種子貴先調經，調經不忘治帶”[18]。對于排卵障礙的不孕癥，班老認為排卵不佳多與肝不生發，腎不作強有關。班老常從調補肝腎著眼，針對不同證候，或溫肝腎之陽，或滋肝腎之陰，或益腎填精養血，使肝腎陰陽平秘，精充血足，以助排卵[19-21]。

溫腎育卵湯是班秀文治療排卵障礙性不孕癥的驗方。方中鹿角霜為君藥，溫腎以助陽。仙茅補腎助陽、益精血；熟地黃養血滋陰，補精益髓；菟絲子具有補腎益精之功；巴戟天補腎助陽、強筋壯骨；紫石英具有鎮心、安神、暖宮之效；上四味共為臣藥。黨參補中益氣，生津養血；當歸身補血活血；蛇床子溫腎壯陽；艾葉溫經散寒；小茴香理氣散寒，助陽健運；花椒芳香健胃、溫中散寒；上五味共為佐藥。炙甘草調和諸藥。諸藥同用，溫補腎陽，健脾養血以助排卵。溫腎育卵湯應用于臨床多年，療效顯著。

本實驗探討了溫腎育卵湯對PCOS模型大鼠卵巢ERα和ERβ表達的影響。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中ERα、ERβ蛋白和基因表達量都呈現不同程度的下降。蛋白表達量的變化和比較通過免疫組化和Western blotting兩種方式進行檢測，兩項檢測結果具有一致性：給藥后，枸櫞酸氯米芬片組和溫腎育卵湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中ERα、ERβ蛋白表達量均有回升，其中溫腎育卵湯高劑量組和枸櫞酸氯米芬片組大鼠卵巢組織中ERα蛋白表達量最明顯，溫腎育卵湯中劑量組大鼠卵巢組織中ERβ蛋白表達量最明顯。溫腎育卵湯高劑量組大鼠卵巢組織中ERα、ERβ基因表達量最明顯。結果表明溫腎育卵湯能提高PCOS大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白和基因表達量，改善卵巢功能，促進卵巢發育和正常排卵。

本項研究顯示溫腎育卵湯對PCOS模型大鼠卵巢ERα和ERβ表達量具有很好的調控作用，有助于恢復PCOS大鼠卵巢ERα、ERβ的表達，驗證了溫腎育卵湯的療效，為臨床推廣提供了實驗數據和理論依據。但此研究為基礎研究，還需更進一步對此方的藥理藥效進行探討，與臨床療效相互佐證。