基于網絡藥理學及分子對接探討半夏厚樸湯對胃食管反流病和抑郁癥“異病同治”的作用機制*

何美君，賈 博，白 光

（1.遼寧中醫藥大學研究生學院，遼寧 沈陽 110847；2.北京中醫藥大學附屬東直門醫院，北京 100700；3.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110033）

隨著當代社會的飛速發展，人們面對的各方面生活壓力隨之增加，近年來胃食管反流疾?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）和抑郁癥（depressive disorder）的發病率均有逐年增高的趨勢，且兩種疾病經常相伴產生并互相影響[1]。GERD是指胃內容物反流入食管造成黏膜損傷的疾病，伴有反酸、噯氣、咽喉異物感等癥狀，且常有患者發生焦慮、抑郁等精神心理異常[2]。抑郁癥是一種情緒障礙性疾病，以心情低落為主癥常伴隨一些胃腸功能紊亂的癥狀[3]。這兩種疾病都具有病程久、費用高、易復發的特點。有研究指出，伴有抑郁的人群患GERD的風險是健康人的1.7倍[4]。抑郁狀態可導致患者出現反酸、腹脹等一系列胃腸道神經調節功能異常的表現，這些胃腸道癥狀又可以反過來加重患者的焦慮、抑郁情緒。如此惡性循環嚴重影響患者的健康。

半夏厚樸湯源自張仲景的《金匱要略》，是被歷代醫家常用的經典方劑，具有疏肝、養血、健脾等功效。半夏厚樸湯在臨床中應用廣泛，其在治療GERD、抑郁癥中療效顯著[5-6]。“異病同治”是指發病機制相同的不同疾病可以運用同種治法。GERD和抑郁癥雖病名不同，疾病過程不同，但發病機制均與肝氣郁結密切相關。因此可以根據“異病同治”的原則，用半夏厚樸湯從肝論治此二病，施以疏肝理氣之法以奏調氣和血，解郁降逆之功。然而，半夏厚樸湯能夠發揮作用的具體細胞分子作用機制仍不明確。本研究擬運用網絡藥理學和分子對接的方法，構建“藥物-靶點-疾病”之間相互作用關系，從多角度探索中藥方劑的有效成分與機體生命活動的互作規律。深入探究半夏厚樸湯“異病同治”GERD和抑郁癥的分子機制，為新藥研發和擴展臨床應用提供依據。

1 方 法

1.1 獲取半夏厚樸湯有效成分及靶點 運用中藥系統藥理數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）檢索半夏厚樸湯中半夏、厚樸、茯苓、生姜、紫蘇5味中藥的所有化學成分。篩選口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性指數（drug-like，DL）≥0.18的化合物及其作用靶點。

1.2 獲取半夏厚樸湯與胃食管反流病和抑郁癥的共有靶點 通過GeneCards數據庫搜集GERD、抑郁癥的疾病靶點。對藥物靶點與疾病靶點取交集，得到半夏厚樸湯與GERD和抑郁癥的共有靶點。

1.3 網絡構建 以“1.1”和“1.2”得到的化合物、靶點、疾病名作為節點，導入Cytoscape3.6.0構建“半夏厚樸湯-共有靶點-疾病（GERD/抑郁癥）”相互作用網絡模型。

1.4 蛋白質相互作用網絡 將“1.2”得到的半夏厚樸湯治療GERD和抑郁癥的共有靶點輸入至String網站構建并繪制蛋白質相互作用關系圖（PPI），設置confidence score值為0.900，將PPI網絡以TSV格式導入Cytoscape3.6.0進行可視化處理。

1.5 生物學功能及通路富集分析 用R3.6.1對共有基因進行基因本體分析（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。

1.6 篩選通路的關鍵靶標 將關鍵通路靶點分別導入String 11.0數據庫。用Cytoscape3.6.0軟件進行Network Analysis網絡拓撲分析，根據度值（Degree）篩選出關鍵靶標。

1.7成分-靶點分子對接 將“1.6”中分析得到的核心靶點與其對應的活性成分進行分子對接。在PubChem數據庫獲取化合物2D結構并保存成SDF格式文件。用ChemOffice軟件修飾化合物的SDF格式文件，使自由能最小并保存成mol2的格式。在PDB數據庫檢索核心靶點并保存為pdb格式，運用PyMOL軟件對受體進行去除水、小分子配體的操作，再用AutoDock－Tools軟件為受體加氫，然后將配體和受體都轉化成pdbq的文件格式保存。最后運用Auto Dock Vina對成分與靶點之間的結合活性進行評價，并用PyMOL軟件可視化。

2 結 果

2.1 半夏厚樸湯中有效成分篩選及靶點的獲取 將半夏厚樸湯中半夏、厚樸、茯苓、生姜、紫蘇5味中藥上傳至TCMSP數據庫，按照OB≥30%且DL≥0.18的標準篩選，半夏厚樸湯中含有49個活性化合物，去重后共獲得124個藥物作用靶點。（見表1）

表1 半夏厚樸湯相關化學成分

2.2 半夏厚樸湯治療GERD和抑郁癥的共有靶點獲取 通過GeneCards數據庫搜集GERD、抑郁癥相關靶點，獲得GERD靶點2 960個，抑郁癥10 105個。疾病靶點與半夏厚樸湯的124個作用靶點取交集，最后得到共有靶點有76個，并繪制Venn圖。（見圖1、表2）

表2 半夏厚樸湯與胃食管反流病、抑郁癥的交集靶點

圖1 半夏厚樸湯與胃食管反流病、抑郁癥靶點交集圖

2.3 半夏厚樸湯治療GERD及抑郁癥網絡圖 將“2.1”及“2.2”得到的有效成分及靶點導入Cytoscape 3.6.0后，構建“半夏厚樸湯-中藥-有效成分-‘GERD、抑郁癥’共有及各有靶點”網絡圖。（見圖2）

圖2 半夏厚樸湯-有效成分-疾病靶點網絡圖

2.4 對共有靶點進行分析 將76個共有靶點導入STRING11.0數據庫，構建共有靶點間的蛋白質相互作用關系網。以TSV格式導入Cytoscape，用“Network Analysis”功能計算各靶點度值（Degree），得到平均值為5.67。其中排在前3名的是蛋白分別是AKT1（Degree=20）、MAPK1（Degree=18）、JUN（Degree=17）。（見圖3）

圖3 蛋白質-蛋白質間相互作用網絡圖

2.5 半夏厚樸湯與GERD和抑郁癥交集基因GO功能富集和KEGG通路富集分析

2.5.1 GO分析GO富集分析結果顯示，分子功能（molecular function，MF）19個，生物過程（biological process，BP）1個。主要包括G蛋白偶聯受體活性、神經遞質受體活性、類固醇激素受體活性、激活轉錄因子結合、乙酰膽堿受體活性等。（見圖4）

圖4 交集靶點GO富集結果氣泡圖

2.5.2 KEGG分析 進行KEGG信號通路富集分析獲得P<0.01的信號通路20條，說明半夏厚樸湯可能作用于PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信號通路中的某些因子從而發揮“異病同治”GERD和抑郁癥的作用。（見圖5）

圖5 交集靶點通路富集結果圖

2.5.3 關鍵通路中蛋白質的相互作用網絡的構建并篩選關鍵靶點 為了深入探索重要通路中各作用靶點的互作關系，將PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1這4條信號通路的靶點分別導入String11.0數據庫，并用Cytoscape3.6.0軟件使結果可視化。節點為蛋白，節點越大、顏色越鮮艷，則蛋白度值（Degree）越高。邊為蛋白間作用關系，線段越粗、顏色越鮮艷則其combine score值越高，作用關系更緊密。保留上述4條通路的網絡分析結果，根據度值對靶點進行排序。結果顯示，滿足度值≥中值，且在通路中出現次數≥3次的靶點共有3個，分別是絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、白細胞介素-6（IL-6）。（見圖6）

圖6 重要通路的蛋白相互作用網絡

2.6 核心靶點蛋白受體與其對應化合物的分子對接結果 將“2.5.3”中篩選得到的核心靶點MAPK1、AKT1、IL-6分別與其對應的主要活性成分（包括木犀草素、β-胡羅卜素、黃芩素）進行分子對接。且這3個化合物在網絡中的度值排在所有化合物的前5名，這表明它們可能作為藥物的關鍵活性成分在網絡中起重要作用。結合自由能是評價配體與受體的結合穩定性的標準?；钚曰衔锖桶悬c蛋白受體間的結合活性度越高，則兩者結合能越低，當結合能≤5.0 kcal/mol，則認為分子與靶點有較好的結合活性，結合能≤-7.0 kcal/mol，表示有強烈的結合活性[7]。分子對接結果顯示，MAPK1、AKT1、IL-6與對應化合物對接結合能均<-7.0 kcal/mol，這提示活性成分可以對核心靶點發揮調控作用，為后續進一步實驗驗證奠定了基礎。（見表4、圖7）

表4 重要靶點與其對應化合物的結合能

圖7 分子對接展示圖

3 討 論

“異病同治”治法是中醫學辨證論治的精華，體現了中醫認識疾病從整體出發的全局觀。中醫學認為GERD的總體病機為胃失和降，氣機上逆，故臨床常用疏肝和胃法來治療GERD[8]。而抑郁癥的病機多為肝氣郁滯，氣機不暢。熊霞軍等[9]通過數據挖掘技術對抑郁癥中醫證候頻數進行統計發現肝郁脾虛證為最常見的證型。情志不暢而肝氣郁結，機體氣機升降失調，或肝失疏泄而橫犯脾胃，最后都會導致中焦脾胃升降失衡，影響脾胃運化功能。脾胃在病理狀態下又會滋生痰濁等病理產物，進一步壅塞氣機，如此形成惡性循環。這與現代醫學的研究認為精神心理因素可通過腦-腸軸影響神經-內分泌-免疫網絡的平衡，同時胃腸道的癥狀也可通過腦-腸軸影響大腦的情感中樞引發心理障礙的觀點一致[10]。由此可見，治療GERD和抑郁癥的根本皆在于調和肝脾，即疏肝解郁，調達中焦脾胃氣機。

本研究為進一步探究半夏厚樸湯“異病同治”GERD、抑郁癥的作用機制，應用了網絡藥理學和分子對接的方法來分析其作用靶點和生物學功能。網絡分析發現半夏厚樸湯治療GERD和抑郁癥主要通過PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信號通路，且通路中的MAPK1、AKT1、IL-6這3個蛋白在網絡中起關鍵作用。

PI3K-AKT是細胞及個體生命活動中很重要的信號通路，是目前許多抗抑郁藥物發揮作用的通路之一。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是具有營養神經細胞作用的一種蛋白質，對突觸可塑性有重要影響，與抑郁癥密切相關。研究表明，在大腦海馬特定區，BDNF水平降低導致體內神經元分化減少，進而影響抑郁行為的發生[11]。PI3K-AKT通路激活后，通過調控下游BDNF等分子可調節突觸可塑性產生抗抑郁效果[12]。Barrett食管是食管內黏膜屏障受損，柱狀上皮取代了鱗狀上皮所產生的病理變化，而GERD是其公認的重要危險因素。與正常食管和反流性食管炎相比，Barrett食管組織表皮生長因子受體（pidermal growth factor receptor，EGFR）、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（erine-threonine protein kinase B，AKT）均明顯上調[13]。這提示PI3K-AKT信號通路可能參與Barrett食管的發生，或能成為防治Barrett食管的有效手段。

IL-17信號通路可通過調節免疫炎癥來影響GERD、抑郁癥。有研究發現，在反流性食管炎大鼠食管組織中IL-17蛋白表達水平均明顯高于正常對照組[14]。Th17細胞是CD4+T淋巴細胞亞群，能特異性地分泌IL-17。抑郁狀態下小鼠腦內IL-17浸潤增加，阻斷Th17細胞形成可提高小鼠抗抑郁能力[15]。

細胞凋亡在GERD和抑郁癥疾病進展中起到重要作用。有研究發現胃、十二指腸內容物反流入食管引起黏膜損傷后，TNF-α、Caspase-3、Survivin等凋亡相關基因、蛋白的異常表達引起黏膜上皮細胞凋亡，是導致食管黏膜上皮損傷的主要原因[16]。現有研究表明[17]，在抑郁癥疾病中小鼠的海馬里有明顯的神經細胞凋亡發生，進而導致抑郁癥的發生。

缺氧誘導因子（HIF）對于維持機體對缺氧的適應能力發揮了重要作用。HIF-1是一種異源二聚體，由α亞基和β亞基組成。HIF-1的調節亞基及活性亞基均為HIF-1α，因此它的生物活性由其α亞基實現。有動物實驗研究發現，HIF-1α被激活時，BDNF和突觸后密度蛋白95（postsynaptic density protein95，PSD95）的表達增加，最終促進海馬神經元生長和突觸可塑性的增加，從而發揮抗抑郁作用[18]。HIF-1α還參與反流性食道炎組織黏膜修復與損傷過程，并發揮重要作用[19]。有研究發現半夏厚樸湯可能通過下調PPARγ、HIF-1α的表達，來改善食道黏膜炎癥狀態下的缺氧微環境，起到治療GERD的作用[20]。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學方法預測了半夏厚樸湯治療GERD和抑郁癥的多成分、多靶點、多途徑的復雜網狀關系，富集分析發現這些靶點在PI3K-AKT、IL-17、凋亡、HIF-1等信號通路中發揮著重要作用，為更深層次探討其作用機制提供了基礎。這與目前研究的GERD與抑郁癥在神經生物學方面有諸多相似機制一致。抑郁癥可能會繼發于GERD，反過來又增加患者對反流癥狀的敏感性，因此深入探究兩病的共同病理機制具有必要性。本研究從微觀角度解釋了半夏厚樸湯可通過一些共同靶點異病同治GERD和抑郁癥，為臨床上合理應用和新藥開發提供依據的同時，也豐富了“異病同治”的科學內涵。