基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的扶正消巖湯抗乳腺癌作用機(jī)制的研究*

馮月男，孔祥定,2，肖洪彬，王寬宇,2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

乳腺癌是女性癌癥死亡的第二大主要原因，它的發(fā)展涉及多種細(xì)胞類型的多個(gè)過(guò)程，其早期診斷是預(yù)防這種疾病的最佳方法之一，同時(shí)，乳腺癌的診斷和治療正經(jīng)歷著從“千篇一律”的方法向個(gè)性化醫(yī)學(xué)時(shí)代轉(zhuǎn)變的過(guò)程。中藥方劑作為個(gè)性化治療癌癥，且具有殺傷癌細(xì)胞及提高免疫力等作用而備受關(guān)注。隨著對(duì)中藥藥理的深入研究，中藥治療癌癥的廣譜性和低毒性逐漸顯現(xiàn)出來(lái)。扶正消巖湯是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王寬宇教授臨床有效方，研究表明該方治療乳腺癌有效，且前期實(shí)驗(yàn)證明了扶正消巖湯能提高乳腺癌荷瘤小鼠的免疫功能，但由于中藥成分復(fù)雜，其所起作用的機(jī)制仍不明確。本研究擬觀察扶正消炎湯對(duì)乳腺癌4T1小鼠模型體質(zhì)量及體內(nèi)乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)的影響。

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）是一個(gè)整合了藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物化學(xué)和藥物-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)-疾病網(wǎng)絡(luò)的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)[1]，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥物學(xué)方法探尋扶正消炎湯治療乳腺癌的活性成分、靶基因及信號(hào)通略，探討扶正消巖湯抗乳腺癌的作用機(jī)制。

1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 乳腺癌細(xì)胞株4T1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雌性Balb/c小鼠30只，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0041。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)安全評(píng)價(jià)中心，12 h晝夜循環(huán)，室溫恒定在22～24℃，相對(duì)濕度55%～65%，小鼠飼養(yǎng)和使用符合國(guó)際動(dòng)物倫理法，并經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.3 藥物 扶正消巖湯，方藥組成：黨參20 g，白術(shù)15 g，陳皮15 g，枸杞子15 g，山萸肉15 g，女貞子15 g，半枝蓮10 g，半夏10 g，莪術(shù)5 g，白芍10 g，茯苓10 g。上述中藥飲片購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）要求；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857，批號(hào)：18050825）。

1.1.4 試劑RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SH3080 9.01）；青鏈霉素（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SV30010）；胰酶[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，批號(hào)：25200-056]；二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：D8371）；PBS（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)：PB18052）。

1.1.5 主要儀器L500型臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；GSPX-Ⅱ型CO2恒溫培養(yǎng)箱（山東博科科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 鼠源乳腺癌細(xì)胞株4T1置于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁情況，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組與造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將細(xì)胞密度為1×107的乳腺癌4T1細(xì)胞于每只小鼠腋窩皮下接種0.2 mL，當(dāng)瘤體積約為5 mm3時(shí)即認(rèn)為成瘤。將30只成瘤小鼠隨機(jī)分為模型組，環(huán)磷酰胺組和扶正消巖湯高、中、低劑量組，每組6只。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)給藥 環(huán)磷酰胺組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，30 mg/kg，扶正消巖湯高、中、低劑量組小鼠灌胃給予扶正消巖湯，生藥量分別為20、10、5 g/kg；模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥2周，2周后脫頸處死取瘤組織進(jìn)行指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1小鼠給藥前后體質(zhì)量 小鼠成瘤后給藥前稱體質(zhì)量，記為給藥前體質(zhì)量；給藥14 d后，脫頸處死各組實(shí)驗(yàn)小鼠，稱量小鼠體質(zhì)量，記為取材前體質(zhì)量；分離各組瘤體，稱取瘤質(zhì)量，并記錄取材前體質(zhì)量－瘤質(zhì)量。

1.2.4.2抑瘤率 將“1.2.4.1”中記錄的瘤質(zhì)量按照公式計(jì)算抑瘤率。抑瘤率計(jì)算公式：（模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1 扶正消巖湯所含化學(xué)成分的收集與藥物調(diào)控靶標(biāo)基因預(yù)測(cè) 以扶正消巖湯中半枝蓮、黨參、莪術(shù)、半夏、陳皮、枸杞、山萸肉、女貞子、白術(shù)、茯苓、白芍、當(dāng)歸組成12味中藥為關(guān)鍵詞通過(guò)搜索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中所含化合物成分和靶基因，遵循藥物活性成分篩選條件，優(yōu)選口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug-like，DL）≥0.18的成分為候選活性成分[2]。通過(guò)Uniprot（www.uniprot.org）將復(fù)方中藥對(duì)應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)名稱簡(jiǎn)寫(xiě)。

2.2 乳腺癌疾病相關(guān)基因收集 將關(guān)鍵詞Breast Cancer錄入GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/），收集疾病相關(guān)基因。

2.3 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò) 扶正消巖湯作用基因與乳腺癌致病基因取交集，將扶正消巖湯有效化學(xué)成分和交集基因?qū)隒ytoscape構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建 為探索靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用，把“3.3”取得的交集基因錄入在線STRING軟件（http://string-db.org），繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用插件CentiScape將置信度設(shè)為0.9，得出核心基因[3]。

2.5 GO生物功能富集分析與KEGG通路富集分析 把“3.4”所得的核心基因上傳至Cytoscape軟件，進(jìn)行靶點(diǎn)的生物功能富集分析（GO富集分析）和信號(hào)通路富集分析（KEGG富集分析）[4]。

3 結(jié) 果

3.1 各組小鼠給藥前后體質(zhì)量比較 各組小鼠給藥前和取材前體質(zhì)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。取材后，扶正消巖湯高、中、低劑量組和環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)均高于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；扶正消巖湯高劑量組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯高于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）；扶正消巖湯中、低劑量組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)與環(huán)磷酰胺組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組小鼠給藥前后體質(zhì)量比較（±s，g）

表1 各組小鼠給藥前后體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與環(huán)磷酰胺組比較，cP<0.05

?

3.2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 扶正消巖湯低、中、高劑量組和環(huán)磷酰胺組小鼠瘤質(zhì)量均低于模型組（P＜0.01或P＜0.05），說(shuō)明扶正消巖湯和環(huán)磷酰胺均可抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)，其中扶正消巖湯高、中、低劑量組的抑瘤率分別為51.6%、42.9%、25.1%，呈劑量依賴性；環(huán)磷酰胺組抑瘤率為92.3%。（見(jiàn)表2）

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

3.3 扶正消巖湯有效化學(xué)成分分析及化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，建立了包括1 320個(gè)化合物在內(nèi)的扶正消巖湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，其中符合OB≥30%，且DL≥0.18條件的候選化學(xué)成分共186個(gè)，合并藥味間共有成分，藥物有效成分共107個(gè)，扶正消巖湯中十二味藥共對(duì)應(yīng)11 337個(gè)靶點(diǎn)，與有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)有1 003個(gè)。乳腺癌致病基因13 229個(gè)，將藥物與疾病的基因取交集，共得到117個(gè)疾病與藥物的交集基因。Cytoscape構(gòu)建扶正消巖湯“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。（見(jiàn)圖1）

圖1 扶正消炎湯與乳腺癌化合物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

4.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了更好地理解扶正消巖湯抗乳腺癌的作用機(jī)制，基于PPI關(guān)系利用STRING軟件構(gòu)建了相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2）。PPI網(wǎng)絡(luò)包含117個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)，1 105條相互作用關(guān)系（連線），其中排在前30的核心基因結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 扶正消炎湯與乳腺癌的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 扶正消巖湯防治乳腺癌的核心基因

3.5 扶正消巖湯防治乳腺癌靶標(biāo)基因功能分析 將117個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中進(jìn)行生物信息學(xué)分析，經(jīng)富集分析發(fā)現(xiàn)扶正消巖湯治療乳腺癌參主要通過(guò)調(diào)節(jié)有機(jī)環(huán)狀化合物、激素、脂質(zhì)、無(wú)機(jī)物、類固醇激素、化學(xué)應(yīng)激、凋亡信號(hào)通路等生物過(guò)程發(fā)揮作用;在細(xì)胞構(gòu)成中，膜筏所占比例最大；在分子功能中，半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性關(guān)系較大。（見(jiàn)圖4）

圖4 扶正消巖湯防治乳腺癌作用生物過(guò)程分析

3.6 KEGG通路富集分析 經(jīng)通路富集分析發(fā)現(xiàn)扶正消巖湯抗乳腺癌的作用通路有113條，P<0.05有113條，P<0.01有93條通路，評(píng)分最高的5條通路的相關(guān)基因及評(píng)分，見(jiàn)表1。其中PI3K-Akt、癌癥中的MicroRNA、MAPK、TNF、NF-κB 5個(gè)信號(hào)通路是扶正消巖湯主要作用的通路，具體作用基因見(jiàn)表3。

表3 扶正消巖湯抗乳腺癌作用通路相關(guān)基因

4 討 論

扶正消巖湯中黨參和半枝蓮為君藥，半枝蓮有清熱解毒、散瘀消腫的功效，黨參具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺的功效。現(xiàn)代研究表明黨參具有抗癌功效，與半枝蓮配伍達(dá)到扶正祛邪的雙重功效；臣藥半夏與莪術(shù)具有破血消積、行氣止痛的功效，用于癥瘕痞塊的治療，且兩者均具有抗腫瘤作用；再臣以白芍養(yǎng)血斂陰止痛，白術(shù)益氣健脾，扶助正氣，共同增強(qiáng)君藥扶正祛邪之功；陳皮行氣止痛，燥濕化痰，枸杞子、山萸肉、女貞子滋陰補(bǔ)腎，諸味臣藥共助君藥扶正之功，提高機(jī)體整體的抗癌效應(yīng)；佐藥以茯苓利水消腫，亦可增強(qiáng)白術(shù)益氣健脾功效，具有扶正祛邪之功，當(dāng)歸活血化瘀，補(bǔ)血行氣，諸藥合用，共奏扶正消巖之功[5-6]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶正消巖湯可以有效抑制小鼠體內(nèi)乳腺癌腫瘤的生長(zhǎng)，且可以促進(jìn)小鼠體質(zhì)量增加，同時(shí)經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出扶正消巖湯主要作用于乳腺癌的5條通路，前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)扶正消巖湯干預(yù)乳腺癌小鼠的細(xì)胞凋亡通路進(jìn)行了研究，研究結(jié)果顯示扶正消巖湯可以下調(diào)Bcl-2、Caspase-9、VEGF的表達(dá)，這與篩選出的PI3K-AKT信號(hào)通路中的3個(gè)基因相重合，因此，推測(cè)扶正消巖湯的抗腫瘤機(jī)制可能通過(guò)干預(yù)PI3K-AKT信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。

PI3K-AKT信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生中起重要作用，并能調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞功能，包括腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，幾乎在所有人類腫瘤（包括乳腺癌）中都發(fā)現(xiàn)了PI3K-AKT信號(hào)通路的改變[7-10]。PI3K在細(xì)胞因子等胞外信號(hào)刺激下，使磷脂酰肌醇的羥基磷酸化、激活PIP3，并迅速結(jié)合其關(guān)鍵下游靶標(biāo)AKT，進(jìn)而使其磷酸化形成有激酶活性的磷酸化p-AKT，活化的AKT通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Caspase-9等下游基因參與腫瘤的形成和發(fā)展過(guò)程。Bcl-2家族作為PI3K-AKT的下游分子，在調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程中占有重要地位。Bcl-2家族分為抗凋亡和促凋亡兩類因子，均在細(xì)胞中起協(xié)同作用，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮開(kāi)關(guān)的作用，其中抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl，主要定位于細(xì)胞線粒體外膜，維持線粒體膜的穩(wěn)定性[11]；促凋亡因子Bax為Bcl-2的顯性抑制因子，可與Bcl-2形成異二聚體，從而使Bcl-2抗凋亡能力下降并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12-13]。而PI3K-AKT信號(hào)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的表達(dá)，引起B(yǎng)ax從細(xì)胞質(zhì)向線粒體的外膜移動(dòng)進(jìn)而發(fā)生寡聚化，促進(jìn)線粒體外膜上離子通道的形成，使線粒體膜的完整性被破壞，降低線粒體膜電位，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-17]。因此，了解PI3K-AKT途徑對(duì)于了解乳腺癌的發(fā)展和進(jìn)程，作為潛在治療靶點(diǎn)的作用，以及該途徑在乳腺癌患者中的預(yù)后和診斷價(jià)值具有重要意義。下一步我們將對(duì)本文分析的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，深入探討扶正消巖湯抗乳腺癌的作用機(jī)制，為其新藥開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。