基于數據挖掘與網絡藥理學探討徐學功治療冠心病PCI術后中藥使用規律與作用機制*

張靜美，陳曉陽，秦慶廣，徐學功

（1.河南中醫藥大學研究生院，河南 鄭州 450046；2.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515；3.河南中醫藥大學附屬鄭州市中醫院，河南 鄭州 450007）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一種常見的心血管疾病，具有高病發率、高死亡率的特點[1]。近年來，隨著社會經濟的發展，心血管疾病的病發率日益提高。冠狀動脈造影是診斷冠心病的“金標準”，在發現“罪犯血管”后，可以續行經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention,PCI），簡稱PCI術，在一定程度上降低了由于急性心血管事件導致的高死亡率，但遠端微栓塞進入冠狀動脈微循環仍限制了進一步的心肌搶救[2]。同時，PCI術后血管的再狹窄率居高不下，相關癥狀的控制情況仍不理想，西藥相關的副作用亦十分多見。中醫善于從整體出發，運用辨證論治的方法遣方用藥，可以有效改善冠狀動脈微循環，能夠較好地改善心功能，亦能在脂代謝、糖代謝、RASS系統調控等方面達到很好的“上游”治療目的，不僅彌補了單純介入治療的不足，同時能夠減少西藥的不良反應。對于冠心病的中藥使用規律，已有學者做過大量研究，但冠心病PCI術后的中藥使用情況及相關藥理學作用機制的研究仍未得到學界重視[3-4]。

仝小林指出：“態靶辨證”是當代中醫辨證論治的新模式，既要在宏觀整體層次去把握疾病本質，更要從微觀靶點層次來提高辨證論治的精準性[5]。徐學功教授師從于仝小林并長期從事于中西醫結合心血管領域的臨床與科研，在冠心病PCI術后的中醫藥治療方面秉承了仝小林“態靶辨證”的思想。徐學功教授認為氣虛血瘀證是冠心病的主要證型，在PCI治療前，患者證型主要以血瘀為主，而PCI治療后的早期階段血瘀表現仍然明顯，進入慢性期以后氣虛的本質慢慢顯現，這主要是因為PCI治療在一定程度改善了患者標實的狀況，但“絡脈”閉塞的情況仍然存在[6]。徐學功教授主張在傳統用藥的基礎上吸納西醫關于冠心病靶向治療的理念，以提高辨治的精準性。故本文搜集整理了徐學功教授在“態靶辨證”思想指導下治療冠心病PCI術后的方藥，并利用數據挖掘與網絡藥理學的方法分析潛在的用藥規律與作用機制，為后續的臨床與科研提供一定幫助。

1 資料與方法

1.1 處方來源 從鄭州市中醫院門診與住院病歷系統調取徐學功教授治療冠心病PCI術后的中醫處方，日期選擇為2017年6月1日至2020年6月1日。

1.2 納入標準（1）方藥信息顯示完整，藥名、劑量清楚；（2）明確診斷為冠心病PCI術后；（3）使用方法為“口服”的方劑。

1.3 排除標準（1）未記錄具體方藥（包括單藥、處方不完整及無處方等類型）；（2）“口服”以外的其他使用方法，如塌漬、熏蒸、外用、穴位貼敷等；（3）同一病人或不同病人的相同方藥只錄入一次。

1.4 中藥錄入 根據《中藥學》和《中華藥典》確定中藥正名，去除炮制法、產地、別稱的影響，對部分藥物進行統一規范化處理，比如姜半夏、法半夏、半夏統一為半夏，茯苓、云茯統一為茯苓等。先由一人操作中醫傳承輔助平臺軟件[7]，將上述處方錄入系統構建方劑數據庫。為確保數據的準確性，由另外兩人進行核對，核對完成后綜合結果進行更正處理。

1.5 用藥規律分析 運用中醫傳承輔助平臺頻數統計功能，篩選出高頻藥物，得到藥物四氣、五味、歸經等結果。其次，將支持度個數設置為20，置信度設置為0.6，進行組方規律分析與規則分析。

1.6 核心藥物有效成分及靶點獲取 將核心藥物組合藥物逐次輸入到TCMSP[8]數據庫中（https://tcmspw.com/tcmsp.php），設置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18進行篩選，得到核心藥物有效成分及作用靶點，將上述靶點導入到UniProt數據庫[9]（https://www.uniprot.org/）中獲取所有靶點的基因名。

1.7 疾病-藥物共同靶基因的獲取 在人類基因數據庫GeneCards[10]（https://genecards.weizmann.ac.il/v3/）中以“coronary heart disease”為關鍵詞進行搜索，獲取冠心病的靶基因，將上述藥物靶基因與疾病靶基因導入到Draw Venn Diagram網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中繪制韋恩圖，并得到“疾病-藥物”共同靶基因。

1.8 關鍵靶點PPI網絡的構建 將上述“疾病-藥物”共同靶基因導入到STRING網站[11]（https://string-db.org/）中，選取物種為“Homo sapiens”，得到靶點蛋白之間的相互作用關系。導出蛋白質互作網絡文件后，利用Cytoscape[12]軟件優化圖形，并根據度值獲取PPI[13]網絡中排名前10的關鍵基因（Hub Gene）。PPI網絡中，靶點以節點顯示，以邊相連接，關鍵靶點的邊更加密集，表示在PPI網絡所起到的作用就更大。

1.9 GO富集分析與KEGG富集分析 將“疾病-藥物”共同基因導入到David數據庫中，選擇物種為“Homo sapiens”進行GO生物功能富集分析[14]與KEGG信號通路富集分析[15]。

1.10 成分-靶點-信號通路網絡圖 將藥物活性成分、作用靶點、信號通路導入Cytoscape 3.6.0軟件中，構建活性成分-作用靶點-信號通路網絡圖。

2 結 果

2.1 處方獲取與用藥規律分析 根據上述納入標準與排除標準，共納入111首方劑。將其導入中醫傳承輔助平臺軟件，對111首方劑中的中藥進行用藥頻數分析，共使用179味中藥，頻次前10名的藥物見圖1。藥物歸經、四氣、五味統計結果見圖2~4。點擊中醫傳承輔助平臺的“藥物模式”，得到13個高頻藥對，包含中藥10味，見表1。點擊中醫傳承輔助平臺的“規則分析”，得到藥物組合規則分析。“關聯規則”的含義：當某藥物出現在一首方劑中，其相伴隨的藥物組合出現的概率。藥物規則分析，見表2。點擊中醫傳承輔助平臺的“網絡展示”功能，得到10味中藥之間相互關系的網絡展示圖，見圖5。

圖1 使用頻數排名前10的藥物

圖2 藥物歸經統計分析圖

圖3 藥物四氣屬性頻數分布

圖4 藥物五味屬性頻數分布

表1 根據關聯規則分析得到的高頻藥物組合

表2 藥物關聯規則分析

圖5 藥物組合網絡展示圖

2.2 核心藥物的有效成分及靶標 從TCMSP網站共得到川芎有效成分7個，丹參有效成分50個。再將上述有效成分分別輸入到TCMSP網站再次檢索，得到有效成分作用靶點，去重后共計61個，然后再將這些靶點蛋白導入到Uniprot網站轉化為相應的基因名。

2.3 “疾病-藥物”共同靶基因 從GeneCards網站獲取到冠心病靶基因6 810個，將疾病與藥物靶點導入到Draw Venn Diagram網站進行韋恩圖分析，得到“疾病-藥物”共同靶基因53個。（見圖6）

圖6 “藥物-疾病”共同基因韋恩圖

2.4 關鍵靶點PPI網絡 將上述53個共同基因導入到STRING數據庫后得到關鍵PPI網絡圖，見圖7。將PPI網絡以TSV格式保存后，在Cytoscape軟件中打開，根據度值得到排名前10的Hub基因（核心基因），見圖8。

圖7 關鍵靶基因PPI網絡

圖8 度值排名前10的Hub基因

2.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析 將上述53個“疾病-藥物”共同靶基因導入到David數據庫進行GO富集分析，與KEGG通路富集分析，根據Pvalue排名將結果可視化其中，GO和KEGG就是基于不同的分類思想而儲存的基因相關功能的數據庫。基因本體富集分析（GO分析），包括3個方面，即生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。根據GO富集分析結果顯示，“丹參-川芎”有效成分具有類固醇結合、序列特異性DNA結合、G蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性等多個生物功能，能夠影響細胞核、突觸、突觸后模等多個細胞組分，從而參與DNA轉錄、細胞凋亡的負調控、乙酰膽堿受體信號傳導、細胞內信號通路傳導、心率調節、突觸傳遞等多個生物過程，進而治療冠心病PCI術后的各種心血管相關癥狀。KEGG通路富集分析顯示，“丹參-川芎”藥對有效成分可以參與癌癥相關信號通路、乙型肝炎信號通路、PI3K-Akt信號通路、甲狀腺激素信號通路等。（見圖9~12）

圖9 生物過程富集分析結果

圖10 細胞組分富集分析結果

圖11 分子功能富集分析結果

圖12 KEGG信號通路富集分析結果

2.6 “丹參-川芎”藥對成分-靶點-通路網絡分析 為了更清晰地展現“丹參-川芎”藥對成分、核心靶點與通路之間的關系，使用Cytoscape軟件構建通路-活性成分-核心靶點網絡。網絡圖包含節點與邊。黃色節點代表藥物有效成分，綠色節點代表中藥名稱，藍色節點代表靶基因，紅色節點代表信號通路。邊表示節點之間的聯系，邊越多，則節點在網絡圖中的作用越大。網絡圖可以直觀展示出“丹參-川芎”具有通過多成分、多靶點、多通路相互協調作用于冠心病PCI術后的特點。（見圖13）

圖13 藥物成分-靶點通路網絡圖

3 討 論

本研究采用數據挖掘的分析方法，研究了徐學功教授治療冠心病PCI術后的111首方藥，共179味藥物。利用中醫傳承輔助平臺，發現頻數排名前10的依次為甘草、丹參、川芎、黃芪、當歸、桂枝、赤芍、茯苓、人參、紅花，可見藥物功效主要集中在活血、補氣、溫陽通脈等方面。歸經排名靠前的藥物分別為心經、脾經、肝經、肺經、胃經等，以歸心經最多。藥物四氣屬性分布排名為溫、寒、平、熱、涼，藥物溫性頻數高達510，占比近50%，反映了治療冠心病PCI術后以溫通心脈為主的治療大法。而五味屬性排名依次為甘、苦、辛等。根據關聯規則發現高頻藥物組合排名靠前的有川芎-丹參、川芎-黃芪、川芎-甘草、紅花-川芎、川芎-當歸、丹參-黃芪、丹參-甘草、赤芍-丹參、黃芪-甘草、甘草-茯苓、甘草-桂枝、甘草-當歸、黨參-甘草。而藥物置信度排名為川芎—＞丹參、紅花—＞川芎、黃芪—＞丹參、赤芍—＞丹參、黃芪—＞甘草、茯苓—＞甘草、桂枝—＞甘草、黨參—＞甘草。可見“丹參-川芎”藥對在治療冠心病PCI術后中具有重要作用，同時黃芪在使用頻數與配伍關系上排名也較高，這與徐學功教授在冠心病PCI術后氣虛血瘀本質的認識是一致的。《本草綱目》曰：“丹參活血，通心包絡，治疝痛。”《別錄》云：“丹參養血，去心腹痼疾結氣，腰脊強腳痹，除風邪留熱。久服利人。”《日華子本草》云：“川芎治一切血，補五勞，調眾脈，破癥結宿血，養新血……及排膿消瘀血。”可見中醫學早就認識到“丹參-川芎”具有活血、化瘀、通心脈的作用。

通過網絡藥理學的方法，得到了“丹參-川芎”藥對與疾病的共同基因，并通過PPI網絡獲取了其中度值前10名的核心基因為TP53、MYC、EGFR、FOS、IL-6、ESR1、CCND1、VEGFA、CASP3、ERBB2。骨髓細胞瘤癌基因（MYC）具有轉錄因子的作用，可促進眾多靶基因的表達，從而在細胞、組織和生物體水平上調控凋亡、增殖和代謝等生理過程。還可以通過驅動免疫細胞中多種代謝基因的表達，從而免疫細胞的分化和激活等起到調控作用[16]。有研究表明雌激素受體1（ESR1）的CC基因型與次要等位基因-397C在男性中有較高的冠心病風險，另外一項Meta分析也佐證了這個觀點[17-18]。血管內皮生長因子A（VEGFA）信號傳導對心肌融合具有直接影響，能夠以劑量依賴性方式調節心臟的形態發生，還可以調節正常或病理性血管內皮生長[19-20]。

根據GO富集分析結果顯示，“丹參-川芎”有效成分具有類固醇結合、序列特異性DNA結合、G蛋白偶聯乙酰膽堿受體活性等多個生物功能，能夠影響細胞核、突觸、突觸后模等多個細胞組分，從而參與DNA轉錄、細胞凋亡的負調控、乙酰膽堿受體信號傳導、細胞內信號通路傳導、心率調節、突觸傳遞等多個生物過程，進而治療冠心病PCI術后的各種心血管相關癥狀。

KEGG通路富集分析顯示，“丹參-川芎”藥對有效成分可以參與癌癥相關信號通路（Pathways in cancer）、乙型肝炎信號通路（Hepatitis B）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、甲狀腺激素信號通路（Thyroid hormone signaling pathway）等信號通路。有研究表明以丹參為主要組成的方劑可以降低磷酸酶基因，通過PI3K-Akt信號通路抑制大鼠細胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，還可以制炎癥和氧化應激水平從而保護心肌，降低動脈粥樣硬化炎癥反應[21-22]。丹參酚酸B可以調控VEGF等靶點，而促進心肌梗死后的血管新生[23-24]。另外，丹參中的二氫異丹參酮Ⅰ、丹酚酸B等成分可以廣泛介導多個癌癥相關信號通路，對細胞的分化、增殖、凋亡起到作用[25-26]。研究表明川芎可以作用于雌激素受體α（ESRα）和缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）等促進血管生成，還可以通過PI3KAkt信號通路顯著降低血脂水平及動脈粥樣硬化程度[27-28]。

綜上所述，本研究利用數據挖掘的方法分析了“態靶辨證”指導下的徐學功教授治療冠心病PCI術后的中醫處方，從宏觀癥候與微觀作用機制作出闡釋，說明了“態靶辨證”客觀的科學性。通過數據挖掘得到了核心藥物組合“丹參-川芎”，隨后利用網絡藥理學探討了該核心藥物組合中的活性成分治療冠心病PCI術后潛在的作用機制，為后續的中醫藥治療及機制研究提供了一定的參考。