鎘脅迫下水培杞柳生理特性及鎘吸收轉運

尹澤潤，羅寶利，羅 鋒，戴鳳賓，諸葛玉平，婁燕宏，王 會，潘 紅，崔秀敏，范利榮

（1. 土肥資源高效利用國家工程實驗室/山東農業大學資源與環境學院，山東 泰安 271018；2. 山東莒南縣農業農村局，山東 臨沂276600；3. 鄒城市農業農村局，山東 濟寧 273500；4. 鄒城市良種繁育中心，山東 濟寧 273518）

在工礦業迅速發展的同時，污水灌溉及工礦業污染導致大量農田土壤鎘含量迅速上升[1]。當前，我國耕地污染狀況不容樂觀，根據2014 年發布的全國土壤污染狀況調查公報，我國土壤點位鎘超標率高達7%[2]。鎘是一種生物生長非必需的劇毒重金屬元素，極易通過具有較高鎘富集系數的作物進入食物鏈威脅人體健康[3]。自20 世紀50 年代日本發生因誤食“鎘米”而導致“水俁病”后，土壤鎘污染便引起學者的廣泛關注[4-5]。 依據我國2018 年8 月1 日實施的最新土壤環境質量標準(GB 15618-2018)[6]，全國43% 的稻田土壤鎘濃度超過其污染風險值[7]，由此來看，鎘污染土壤修復已迫在眉睫。

植物修復是一種環境友好型的重金屬污染土壤修復方式[8-10]，而用于土壤污染修復的植物多是重金屬的超富集植物與具有較高累積能力的高生物量植物。柳屬(Salix)植物是用于鎘污染土壤植物修復的一類高生物量植物[11-12]。其中，杞柳(Salix integra)是柳編織品的重要原料，具有適應性強、易繁殖、生長迅速等優點，在我國廣泛栽培，具有重要的經濟價值。當前有研究表明杞柳對鎘脅迫具有一定耐受性且對鎘具有一定的吸收能力[13-14]。同時，杞柳可有效促進鎘污染土壤中微生物的代謝活性、豐度及多樣性指數，還可提高土壤養分水平[15]，但杞柳對鎘脅迫的生理響應以及對鎘的富集轉運特性仍有待進一步研究。同時，杞柳作為一種依靠營養體扦插繁殖的植物，其根系建成受鎘脅迫的影響仍缺乏更加深入的探索，限制了對杞柳修復鎘污染土壤可行性的認識。因此，本研究通過水培扦插杞柳苗的方式，研究鎘對杞柳根系構型的影響及其生理響應機制，明確杞柳對鎘的吸收轉運特性，以期為杞柳在鎘污染土壤修復中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試杞柳品種為大青葉，繁育保存于山東農業大學試驗站。剪取杞柳的頂端枝條(17 cm)，去掉頂部嫩芽(2 cm)，扦插于盛有1/2 Hoagland 營養液的水培箱中，培養至長出3～5 條不定根和嫩葉后，選取長勢一致的杞柳苗進行試驗。

1.2 試驗設計

試驗于2018 年4 月 - 5 月在山東農業大學溫室中(22 ± 4 ℃)進行。采用水培試驗，將長勢一致的杞柳苗分別移入1 L 的塑料瓶中(每個塑料瓶中移入1 棵杞柳苗)，加入1/2 Hoagland 營養液并將相應濃度的CdCl2(分析純) 溶解其中，進行鎘脅迫試驗。以只用1/2 Hoagland 營養液的對照處理記為CK，鎘處理分別記為C10、C20、C30和C40，對應的鎘濃度分別為10、20、30 和40 mg·L?1。每個處理4 次重復，隨機排列。處理14 d 后，將植株取出，先將根系浸泡于20 mmol·L?1EDTA Na 溶液中30 min，再用雙蒸水洗凈以去除螯合附著在根系表面的鎘，隨后對樣品進行檢測。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長指標

分別于處理開始前和處理結束后獲取始末生物量(干重)，并計算相對生長速率(relative growth rate,RGR)[16]。

式中：M0為處理前杞柳干重，M1為處理后杞柳干重，d為處理時間(14 d)。

處理結束后，把植株按照莖、莖表皮、葉片、根系分離，測定根系構型后稱取測定生理指標用樣品，其余樣品置于105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重，得到樣品干重。

1.3.2 根系構型

把根系放入根系掃描儀Epson V700 的玻璃槽中，注入1 cm 深的去離子水使根系充分散開，必要時使用鑷子將根系調整散開以避免根系重疊交叉，掃描獲取圖像，將圖像導入Win RHIZO 根系分析系統中進行分析獲取根系形態數據(根系總長度、平均直徑、體積、表面積、分形維數、連接數、節點數、根尖數、分叉數)。

1.3.3 生理指標

參考高俊鳳[17]的方法，準確稱取0.5 g 葉片(根系) 置于預冷處理的研缽中，用液氮研磨后，加入5.0 mL 磷酸緩沖液(pH 7.0)轉移到離心管中，4 ℃離心10 min，收集上清液用于杞柳葉片和根系產生的超氧陰離子活力單位、谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量和過氧化氫酶(catalase, CAT)活性的測定；參考Halliwell 和Foyer[18]的方法測定谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)活性。

1.3.4 鎘的吸收轉運

將烘干樣品磨碎過0.25 mm 篩，分別稱取樣品(根系0.1 g，葉片、莖表皮和莖分別稱取0.2 g)置于石墨坩堝中，在馬福爐490 ℃下灰化50 min。將灰化好的材料，加入15 mL 混合酸(HCIO4∶ HNO3體積比為1 ∶ 4)，轉移至消煮管中消煮至澄清，定容至50 mL 容量瓶中，用原子吸收分光光度計測定溶液中鎘濃度，計算各器官鎘含量，并按以下公式計算鎘的去除率[19]、轉移系數(translocation factor, TF)[20]、富集系數(bioconcentration factor, BCF)[21]：

去除率 = 植株吸收富集的鎘含量/處理前營養液中的鎘含量 × 100%；

富集系數 = 植株富集鎘濃度/營養液中鎘濃度；

轉移系數 = 地上部鎘濃度/地下部鎘濃度。

1.4 數據分析

所有數據均為4 次重復的平均值，使用Excel 2010 進行做圖和數據處理。采用SPSS 軟件17.0 通過Probit 回歸分析計算IC50(半抑制濃度)，并進行方差分析(多重比較方法為Duncan)，比較不同處理間在P< 0.05 的顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對杞柳生長及根系構型的影響

2.1.1 鎘脅迫對杞柳生長影響

鎘脅迫下杞柳的相對生長速率有顯著降低(P<0.05)，且抑制作用隨脅迫濃度增加而增大(圖1)，下降幅度為8.88%～59.21%，但C30與C40處理間無顯著差異(P> 0.05)；分析得出，杞柳鎘脅迫的半抑制濃度為25 mg·L?1。在高濃度的鎘脅迫下(C30、C40)，其生長雖然受到抑制，但仍能存活并保持一定的相對生長率[15.85～17.61 mg·(g·d)?1]，表明杞柳對鎘脅迫具有較強的耐受性。

圖1 不同處理杞柳的相對生長率Figure 1 Relative growth rate of Salix integra following different treatments

杞柳各部位生物量在不同鎘濃度脅迫下所受影響不同(表1)。莖和莖表皮生物量在不同鎘濃度處理下顯著下降(P< 0.05)，C10、C20、C30處理間差異不顯著(P> 0.05)，且均大于C40(P< 0.05)；葉片生物量在C20處理下顯著下降(P< 0.05)，C10、C20處理顯著大于C30、C40(P< 0.05)，C10和C20處理之間、C30和C40處理之間差異均不顯著(P> 0.05)；杞柳根系生物量與CK 相比，僅在C40處理下顯著下降43.23%(P< 0.05)。可見，杞柳地上部對鎘脅迫的抑制作用更為敏感，而根系對鎘脅迫具有更強的耐受性。

表1 不同處理杞柳各部位生物量Table 1 Biomass of different parts of Salix integra following different treatments g

2.1.2 杞柳根系生長構型

對照處理下杞柳根系發達且側根茂密，而鎘脅迫下側根隨脅迫濃度升高而逐漸稀疏(圖2)。鎘脅迫對杞柳根系總長度的影響表現為“低促高抑”的趨勢，C10較CK 顯著提高8.85% (P< 0.05)；C20、C30與CK 差異不顯著(P> 0.05)，而C40較CK 顯著下降21.45% (P< 0.05)，且鎘處理間隨濃度提高根系總長度顯著下降(P< 0.05) (圖3)。較CK，鎘脅迫顯著降低了根系表面積、平均直徑和體積(P< 0.05)，且下降幅度隨處理濃度提高有增加趨勢。C10、C20處理平均直徑顯著大于C30、C40(P< 0.05)，且C10與C20、C30與C40處理間均無顯著差異(P> 0.05)；根系體積隨鎘處理濃度增加而顯著降低(P< 0.05)；C10、C20處理根系表面積顯著大于C30、C40(P< 0.05)，且C10、C20間差異不顯著(P> 0.05)，但C30處理的根系表面積顯著大于C40(P< 0.05)。因此，杞柳在鎘脅迫下根系建成受到抑制，根系表面積、平均直徑和體積均下降，盡管根系總長度在低濃度下受刺激增長，但鎘脅迫濃度繼續增加后，根系總長度也逐漸降低。

圖2 不同處理杞柳根系掃描圖Figure 2 Root system scan of Salix integra following different treatments

圖3 不同處理杞柳根系總長度、平均直徑、體積、表面積Figure 3 Root total length, average diameter, volume, and superficial area of Salix integra following different treatments

較CK 處理，鎘處理的杞柳分形維數、分叉數均無顯著差異(P> 0.05)；連接數僅C40處理顯著提高22.06% (P< 0.05)，其余鎘處理均與CK 無顯著差異(P> 0.05)；根系節點數和根尖數在各鎘處理下較CK 均顯著增加(P< 0.05)，增加幅度在43.57%～51.98%和17.52%～28.73% (表2)。分形維數在各鎘處理間，僅C40較C30顯著下降了29.84% (P< 0.05)，其余鎘脅迫處理間均無顯著差異(P> 0.05)；杞柳根系連接數、節點數、根尖數和分叉數均在各鎘脅迫處理間差異不顯著(P> 0.05)。

表2 不同處理杞柳根系構型指標Table 2 Root configuration index of Salix integra following different treatments

2.2 鎘脅迫對杞柳抗氧化酶活性的影響

與CK 相比，僅C40處理下杞柳葉片產生超氧陰離子活力單位無顯著差異(P> 0.05)，其他鎘處理下杞柳根系和葉片的產生超氧陰離子活力單位顯著上升24.12%～55.12% (P< 0.05)，且杞柳根系和葉片中產生超氧陰離子活力單位均隨鎘處理濃度增加表現為“先增后減”，并在C20處理下達到最高水平(圖4)。鎘脅迫處理顯著提高了杞柳體內的CAT酶活性(P< 0.05)，根系和葉片中分別上升了7.60%～26.90%與41.95%～135.29%，但葉片中CAT 酶活性隨鎘處理濃度增加先上升后下降，在C20處理下最高，且C10、C30、C40處理間差異不顯著(P> 0.05)，而根 中CAT 酶 活 性C10、C20處 理 顯 著 小 于C30、C40處理(P< 0.05)，但C10與C20、C30與C40處理間差異均不顯著(P> 0.05)；C20、C30和C40較CK 處理顯著降低了葉片和根系的GSH 含量(P< 0.05)，但C10與CK 處理間差異不顯著(P> 0.05)；鎘處理顯著降低了杞柳根系和葉片GR 酶活性35.59%～58.25% (P<0.05)，葉片中GR 酶活性C10、C20處理顯著大于C30、C40處理(P< 0.05)，但C10與C20、C30與C40處理間差異均不顯著(P> 0.05)，根系GR 酶活性在各鎘處理間，僅C40顯著小于C20處理，下降26.94% (P<0.05)，其余鎘處理間均無顯著差異(P> 0.05)。

圖4 不同處理杞柳的產生超氧陰離子活力單位、過氧化氫酶活性、谷胱甘肽含量、谷胱甘肽還原酶Figure 4 Superoxide anion promoter, CAT, GSH, GR of Salix integra following different treatments

2.3 杞柳對鎘的吸收轉運

杞柳對鎘的吸收轉運特性是其對鎘污染土壤修復潛力的重要體現，隨著鎘濃度的不斷增加，杞柳地上、地下部鎘的富集濃度均持續顯著上升(P<0.05)，各個鎘脅迫處理下杞柳地上部鎘濃度均大于100 mg·kg?1(表3)。在C10處理的去除率最高(27.35%)，C20、C30和C40處理的去除率顯著小于C10(P< 0.05)，但C20、C30和C40間差異不顯著(11.27%～14.97%)(P> 0.05)，且杞柳吸收的鎘主要富集在葉片中，其次為根系、莖表皮中，莖最低(圖5)。C20、C30、C40處理的杞柳轉移系數顯著大于C10(P< 0.05)，但C20、C30、C40處理間差異不顯著(P> 0.05)。此外，杞柳富集系數隨鎘處理濃度增加而顯著下降(P< 0.05)，表明高濃度的鎘脅迫處理促進鎘從根系到地上部的運移，但杞柳的富集能力會受到高濃度鎘脅迫的限制。

圖5 不同處理杞柳植株鎘的分配及鎘去除率Figure 5 Distribution of Cd in plants and removal rate of Cd in Salix integra following different treatments

表3 不同處理下杞柳植株鎘濃度及吸收轉運特性Table 3 Cd concentration in plants, absorption and transportation characteristics of Salix integra following different treatments

3 討論

杞柳有抗雨澇、生根迅速、根系發達、生長快速、易繁殖等特點，具有作為鎘污染修復材料的潛力。已有研究主要通過描述鎘脅迫下杞柳生物量的變化以表征杞柳的耐鎘性[13-14]，而本研究依據不同濃度的鎘脅迫處理下杞柳生物量的變化，通過統計分析得出鎘脅迫對杞柳的半抑制濃度為25 mg·L?1，進一步明確杞柳對鎘脅迫的耐受性。同時，因為杞柳具有一次扦插多年收割的特性，地上部大量富集的鎘可通過收割來提取，從而達到修復鎘污染的目的[22]。為了進一步了解鎘在杞柳植株體內的分配，將杞柳分為莖、莖表皮、葉片、根系四部分進行鎘濃度測定，得出鎘富集的表現為葉片 > 根系 > 莖表皮 >莖。而杞柳莖是良好的編制材料，莖中鎘的低積累也為其作為產品創造經濟效益而無安全風險提供了理論支撐。但是，這與張曉麗等[23]對27 種無性柳的研究不一致，其富集的鎘多集中于根系，這種差異可能是因品種不同而異。本研究發現，在大于10 mg·L?1的鎘污染營養液中，杞柳地上部鎘濃度均大于100 mg·kg?1，且其轉運系數大于1[24]，表明杞柳對鎘不僅具有較強的耐受性，而且可作為新型的超積累植物應用于鎘污染土壤修復。

鎘脅迫下，植物細胞受過量鎘的影響產生大量超氧陰離子，從而導致植物體內的D1 蛋白受到氧化損傷[25]，超氧陰離子生成速率的增加將導致植物衰老死亡[26]。同時，植物體內也會激發相應的抗氧化機制來清除細胞內過量的過氧化物質，過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽(GSH)均為植物抗氧化系統的重要組成部分[27-29]。杞柳在受到鎘脅迫后，葉片與根系中的產生超氧陰離子活力單位上升，表明鎘脅迫致使杞柳體內形成氧化脅迫。而杞柳葉片和根中CAT 酶活性在鎘脅迫下上升，有研究表明CAT 酶可有效清除植物細胞內的過氧化物質，因此，杞柳通過提高體內CAT 酶活性來緩解自身所受氧化脅迫[30]。同時，杞柳葉片CAT 酶活性隨鎘處理濃度增加呈“先升后降”的變化趨勢，這與郭艷陽等[31]發現玉米(Zea mays)葉片在氧化脅迫下CAT 酶活性隨脅迫增強表現為先上升后下降的結果相一致。有研究認為，中度氧化脅迫促使植物體內抗氧化酶活性上升以清除過氧化物質，但嚴重的氧化脅迫會抑制植物抗氧化酶的活性[32]。GR 酶是維持抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)平衡的關鍵酶，可將氧化型谷胱甘肽(GS-SG)還原為谷胱甘肽(GSH) 來緩解植物所受脅迫[33]。本研究還發現，葉片和根系的GSH 含量隨著鎘濃度增加而逐漸下降，這可能是與其大量合成植物螯合素與鎘螯合緩解杞柳鎘脅迫密切相關[34]。有研究表明植物和分裂酵母菌可以合成鎘結合肽，用于響應和抵御鎘脅迫，這種植物螯合素是從GSH 衍生而來[35]。此外，杞柳葉片和根系GR 活性在鎘脅迫下顯著降低(P<0.05)，這與王紅等[36]發現鎘脅迫降低水稻(Oryza sativa) GR 酶活性的結果相一致。

杞柳主要通過扦插進行繁育，因此研究鎘脅迫對杞柳根系生長發育的影響，可進一步明確其作為鎘污染修復植物的潛力[37]。試驗表明，杞柳根系的響應分為兩方面，一方面是杞柳根系體積、表面積等隨鎘濃度的上升而受到抑制，根系體積在C10處理時下降38.39% (P< 0.05)，并且脅迫的抑制作用隨鎘濃度增加而增強，在C40處理時下降幅度高達92.73% (P< 0.05)，這與王樹鳳等[14]研究發現的鎘脅迫下杞柳根系體積下降的結果相一致；另一方面，杞柳根系分形維數、連接數、節點數、根尖數和分叉數受到鎘脅迫的誘導上升，這與李小艷等[38]對杞柳在鹽脅迫下根系的響應相一致，在受到鹽脅迫后根尖數存在“低促高抑”的變化趨勢。因此，杞柳根系在受到鎘脅迫后根系體積與表面積等降低，但根系根尖數與節點數等上升，從而在根系生長受阻的情況下維持養分吸收的能力[39]。綜上所述，杞柳在鎘脅迫下根系生長形態改變以及葉片與根系生理生化反應的調節能力，體現了杞柳對鎘脅迫的抗逆響應及其應用于鎘污染土壤的修復潛力。

4 結論

杞柳幼苗對鎘脅迫具有較強的耐受性，其鎘脅迫的半抑制濃度為25 mg·kg?1。同時，杞柳幼苗具有較高的鎘富集轉運特性(TF > 1；BCF > 10)，吸收的鎘主要富集于葉片，有利于通過收割地上部移除污染土壤中的鎘。在鎘脅迫下，杞柳幼苗葉片和根系的產生超氧陰離子活力單位上升，且CAT 酶活性上升以清除過氧化物質，同時葉片和根系GR 酶活性與GSH 含量下降。此外，雖然鎘脅迫抑制了杞柳幼苗的生長，但提高了根系分形維數、連接數、節點數、根尖數和分叉數，促進其根系構型形成，增強根系養分吸收能力保障植物生長。綜上所述，杞柳具較強的耐鎘性并在鎘污染土壤修復中具有較好的應用潛力。