健步湯對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型骨密度及血清TNF-α、IL-6、IL-1表達(dá)的影響*

馮帥華，肖文仲，王國(guó)峰，張曉晟，胡桔花，王哲享

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis,OP）[1]是一類以骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，造成骨強(qiáng)度下降，最終導(dǎo)致骨折等其他全身性骨病的疾病。隨著老年人口比重的逐年升高，OP已成為各國(guó)常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人們健康的慢性疾病之一[2]，直接或間接影響生活質(zhì)量。目前西藥在治療骨質(zhì)疏松癥方面有一定的療效，但同時(shí)伴有一定副作用，如長(zhǎng)期激素治療可出現(xiàn)凝血功能障礙、高血壓、水腫、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等[3-6]。中藥防治OP安全性高、毒副作用小，但目前并沒(méi)有公認(rèn)的中藥制劑。筆者在臨床中運(yùn)用健步湯治療老年性骨質(zhì)疏松癥療效滿意，為進(jìn)一步研究健步湯的作用機(jī)制，筆者借助去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，觀察健步湯對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型骨密度及血清TNF-α、IL-6、IL-1的影響，探討其部分作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 44只SPF級(jí)6個(gè)月齡健康雌性（未交配）SD大鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，體質(zhì)量230～250 g，由湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫控制于18～28 ℃，12 h間隔照明，定期消毒和通風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，批號(hào)：倫審（201701）25號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 健步湯：龜甲膠、鹿角膠、狗骨、制何首烏、川牛膝、杜仲、鎖陽(yáng)、當(dāng)歸、熟地黃、威靈仙各12 g，黃柏、人參、羌活、白芍、白術(shù)、附子各9 g，中藥均由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院藥劑科提供。戊酸雌二醇片（法國(guó)DELPHARM Lille S.A.S，藥物批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20080036）。

1.3 主要儀器與試劑 自動(dòng)脫水機(jī)（湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司），珊頓包埋機(jī)（青島方信醫(yī)巧器械有限公司），冰凍切片機(jī)（英國(guó)珊頓公司），顯微鏡（奧林巴斯（中國(guó)）有限公司）。Motic6.0圖文分析系統(tǒng)（美國(guó)Hologic公司），HOLOGIC4 500A型雙能X線骨密度掃描儀（美國(guó)Hologic公司），徠卡病理系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號(hào)：20180614）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒（批號(hào)：20180614）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）試劑盒（批號(hào)：20180614）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 造模及分組 44只雌性SD大鼠，隨機(jī)選取12只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組僅行手術(shù)摘取卵巢旁約卵巢大小的脂肪組織，不予切除卵巢和結(jié)扎輸卵管，其余32只大鼠全部行雙側(cè)卵巢切除。采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠去卵巢3個(gè)月可形成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松病理模型。

造模步驟：2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，備皮消毒，取腹背部中線第2腰椎水平做長(zhǎng)約2 cm雙背側(cè)縱行切口，依次分離進(jìn)入腹腔，尋找卵巢組織，平鑷將卵巢牽出，嚴(yán)密結(jié)扎輸卵管及其周?chē)堋⒅窘M織，完整切除雙側(cè)卵巢，沖洗傷口，止血徹底，逐層縫合，關(guān)閉腹腔，術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素20萬(wàn)U，預(yù)防感染。連續(xù)喂養(yǎng)12周后，假手術(shù)組與手術(shù)組各隨機(jī)處死2只行股骨HE染色鏡下觀察，假手術(shù)組切片鏡下可見(jiàn)大量清晰成骨細(xì)胞，形態(tài)完整，骨小梁致密，形態(tài)規(guī)則，生長(zhǎng)旺盛，排列有序；與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠股骨骨小梁數(shù)量異常減少、粗細(xì)不均、排列無(wú)序且斷裂明顯。（見(jiàn)圖1）

圖1 兩組大鼠股骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE，×100）

大鼠剩余40只股骨全部行骨密度（BMD）檢測(cè)，結(jié)果顯示手術(shù)組大鼠股骨BMD顯著低于假手術(shù)組（P<0.05），與HE染色結(jié)果一致，證明實(shí)驗(yàn)造模成功。（見(jiàn)表1）

表1 假手術(shù)組與手術(shù)組大鼠股骨BMD 比較（，g/cm2）

表1 假手術(shù)組與手術(shù)組大鼠股骨BMD 比較（，g/cm2）

造模成功的30只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、中藥組和西藥組，每組10只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)12周，于第13周開(kāi)始給藥，中藥組及西藥組灌胃每日所需給藥劑量根據(jù)人的臨床劑量（X mg/kg）按照人體和大鼠體表面積比換算：

中藥組大鼠予健步湯灌胃：按其原處方量計(jì)算，成人每日劑量174 g即2.48 g/kg生藥，換算成大鼠等效劑量則生藥劑量為2.48 g/kg×6.3＝15.66 g/kg；參考前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效劑量，本實(shí)驗(yàn)取健步湯每日劑量為20 g/kg，1次/d。藥物煎制方法：每次將2劑藥物，共計(jì)348 g，分2次煎煮，每次煎煮時(shí)間約為30 min，合計(jì)加水2 000 mL，合并2次煎液，并濃縮至348 mL，生藥濃度為1 g/mL，每周制備1次，將煎好的中藥真空包裝冷藏保存?zhèn)溆谩Ｎ魉幗M大鼠予戊酸雌二醇片灌胃：按照成人每日給藥劑量1 mg口服，換算成大鼠等效劑量為0.014 mg/kg×6.3＝0.40 mg/kg，1次/d。假手術(shù)組、模型組大鼠予等容量生理鹽水灌胃，3mL/次，1次/d。

以上藥物連續(xù)給藥12周后，處死所有大鼠，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 骨密度BMD 灌胃12周后將大鼠進(jìn)行麻醉，仰臥位置于QDR-4500A雙能X線骨密度診斷儀上，測(cè)量分析股骨近端干骺端及第4腰椎、第5腰椎BMD。

1.6.2 炎癥因子 分別將受試大鼠采用1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血2 mL，離心10 min（3 000 r/min）分離血清5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎秒p抗夾心法測(cè)定大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1水平。

1.6.3 骨組織形態(tài)學(xué) 將大鼠麻醉處死后取股骨，對(duì)股骨標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)處理后，用生理鹽水沖洗，股骨標(biāo)本固定于4%的多聚甲醛24 h，然后加入含5.5%EDTA的10%中性福爾馬林溶液進(jìn)行脫鈣36 h，放置梯度乙醇逐漸脫水、浸蠟、石蠟包埋，正中矢狀面連續(xù)切片，切片厚為5 μm，然后使用蘇木精-伊紅染液進(jìn)行染色，光鏡下隨機(jī)選取兩組骨組織高倍視野拍照，并觀察切面單位視野內(nèi)的骨小梁、軟骨細(xì)胞等，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（）表示。符合方差齊性檢驗(yàn)時(shí)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中4組大鼠狀況良好，行造模手術(shù)后1周，由于受麻醉劑及相關(guān)器官損傷的影響，進(jìn)食量稍低，體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)明顯差異。大鼠造模手術(shù)切口均在1周內(nèi)愈合。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)大鼠死亡。

2.2 各組大鼠腰椎、股骨BMD比較 給藥12周后，模型組大鼠腰椎、股骨BMD水平顯著低于假手術(shù)組（P<0.05）；中藥組及西藥組大鼠腰椎、股骨BMD顯著高于模型組（P<0.05）；中藥組與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠腰椎、股骨BMD 比較（，g/cm2）

表2 各組大鼠腰椎、股骨BMD 比較（，g/cm2）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平均明顯高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；西藥組與中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平與西藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)表3）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1 水平比較（）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1 水平比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 假手術(shù)組大鼠股骨切片鏡下可見(jiàn)大量清晰成骨細(xì)胞，形態(tài)完整，骨小梁致密，形態(tài)規(guī)則，生長(zhǎng)旺盛，排列有序。模型組大鼠股骨切片鏡下可見(jiàn)骨小梁排列疏松，數(shù)量明顯低于假手術(shù)組，部分骨小梁出現(xiàn)斷裂及鈣鹽沉積減少等骨質(zhì)疏松特征性表現(xiàn)。西藥組大鼠股骨切片鏡下可見(jiàn)骨組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，骨小梁相對(duì)完整，骨小梁較致密，骨小梁間有少量斷裂，形態(tài)相對(duì)規(guī)則。中藥組大鼠股骨切片鏡下可見(jiàn)骨組織結(jié)構(gòu)完整,骨小梁較模型組增多明顯，骨小梁間無(wú)明顯斷裂,成骨細(xì)胞排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)規(guī)整，成網(wǎng)狀相連續(xù)，鈣鹽沉積較多。（見(jiàn)圖2）

圖2 各組大鼠股骨骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE，×100）

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥是以骨密度及骨質(zhì)量下降、微結(jié)構(gòu)改變等為主要表現(xiàn)，導(dǎo)致骨脆性增加、骨折及全身性骨病發(fā)生的一類與年齡相關(guān)的代謝性疾病。臨床上以原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥較為常見(jiàn)，包括Ⅰ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥（絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥）和Ⅱ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥（老年骨質(zhì)疏松癥）。增齡和不健康生活方式是骨質(zhì)疏松癥高發(fā)的主要原因[7]。2018年國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布中國(guó)骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示：OP已成為我國(guó)中老年人群的重要健康問(wèn)題，50歲以上人群患病率為19.2%，且女性發(fā)病率明顯高于男性。目前，臨床治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要包括骨吸收抑制劑（雙磷酸鹽、降鈣素、雌激素等）、骨形成促進(jìn)劑（甲狀旁腺激素類似物）及其他機(jī)制類藥物（活性維生素D及其類似物、維生素K2類等）。

免疫炎性反應(yīng)是介導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的重要因素之一[8]，TNF-α是一類重要的單核炎癥因子，可以通過(guò)抑制細(xì)胞外基質(zhì)沉積，降解有機(jī)骨質(zhì)，參與調(diào)節(jié)骨吸收，通過(guò)介導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖分化影響骨代謝[9]。IL-6是具有多種生物學(xué)作用的炎癥因子，在骨的多種生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[10-12]。實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為IL-6可參與加強(qiáng)成骨、破骨細(xì)胞相互作用從而促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。IL-1可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，使骨吸收與骨破壞失衡誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松，與IL-6相互協(xié)同[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1含量明顯低于模型組，說(shuō)明健步湯可干預(yù)炎癥因子對(duì)破骨細(xì)胞的影響，降低破骨細(xì)胞活化。

中醫(yī)學(xué)中無(wú)“骨質(zhì)疏松癥”的病名，但依據(jù)其癥狀和發(fā)病特點(diǎn)，應(yīng)歸屬于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇。其主要病機(jī)為腎精虧耗[14]。《素問(wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論篇》云：“年四十而陰氣自半也，起居衰矣”，腎臟虛損，沖任失調(diào)，天癸漸竭；腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨骼，故腎精充盈則養(yǎng)骨、健骨，腎精虧損則無(wú)以濡養(yǎng)筋骨。

健步湯由《傷科補(bǔ)要》中的“健步虎潛丸”化裁而來(lái)，健步湯的組方原則為補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛痹痛。方中龜甲膠咸甘微寒，滋陰潛陽(yáng)；鹿得陽(yáng)氣之精華，鹿角膠可溫補(bǔ)腎陽(yáng)；兩藥合用取“龜鹿二仙膠”之意，與熟地黃共為君藥，發(fā)揮滋補(bǔ)肝腎之功；人參補(bǔ)中益氣，與鹿角膠同用，可補(bǔ)氣助陽(yáng)，與龜甲膠同用，可益氣生津；制何首烏、白芍、當(dāng)歸柔肝養(yǎng)血；杜仲、鎖陽(yáng)強(qiáng)筋健骨；川附子、狗骨（虎骨替代品）散寒止痛，共為臣藥；佐藥羌活、威靈仙祛風(fēng)濕，黃柏清熱燥濕，白術(shù)健脾化濕，四藥合用共奏祛濕止痛之效；牛膝引血下行，活血化瘀，調(diào)和諸藥為使藥。諸藥合用功擅滋補(bǔ)肝腎、益氣活血、祛風(fēng)除濕，使陰陽(yáng)調(diào)和、筋骨強(qiáng)健。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[15-18]表明，健步湯中多味單藥有效成分可通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、抗炎、抗氧化等作用，可有效延緩骨質(zhì)疏松的病理進(jìn)程。前期研究表明[19]，健步虎潛丸可明顯改善原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者臨床癥狀、促進(jìn)骨代謝，且補(bǔ)益肝腎類中藥[20]安全性高，療效顯著。羅毅等[21]研究表明經(jīng)健步虎潛丸血清處理后的大鼠成骨細(xì)胞，可從活躍轉(zhuǎn)向成熟狀態(tài)，且不同濃度及時(shí)間對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定影響，表明健步虎潛丸對(duì)促進(jìn)骨形成有著重大意義。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，健步湯可增加大鼠股骨骨小梁數(shù)量、厚度，促進(jìn)鈣鹽沉積，證實(shí)健步湯具有強(qiáng)骨作用。

綜上所述，健步湯可有效改善去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥模型的骨代謝程度，提高骨密度，其作用機(jī)制可能與降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1表達(dá)相關(guān)。健步湯能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，降低破骨細(xì)胞活性，改善骨小梁結(jié)構(gòu)，從而延緩骨質(zhì)疏松進(jìn)程，其療效與西藥雌激素類作用相當(dāng)，但健步湯中組成方藥較多，其有效成分及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。