丹酚酸B誘導血管新生對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護機制及凋亡相關蛋白研究*

張愛婷，王春光，要 彤，趙小祺，張文婷

（1.河北北方學院附屬第一醫院，河北 張家口 075000；2.河北北方學院基礎醫學院，河北 張家口 075000）

據《中國心血管健康與疾病報告2019》報道，我國心血管發病率逐年增長，危險因素流行趨勢明顯，控制狀況仍不容樂觀，未來10年仍將展現快速增長的態勢[1]。心血管病負擔逐漸加重，已經成為當今重大的公共衛生問題。隨著冠狀動脈血運重建技術的發展，多種治療方法在冠心病的治療中取得顯著的效果。但是缺血心肌恢復血流灌注可能引發再灌注損傷，甚至造成可逆的心肌細胞損傷，降低臨床治療效果，該現象被稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemio-reperfusion injury，MIRI）[2]。MIRI的發病涉及細胞凋亡、炎癥反應、氧自由基等多種機制，均可損害微血管內皮功能，加重心肌缺血，最終導致微血管病變[3]。因此，MIRI防治工作的關鍵在于改善冠狀動脈微循環。丹參是傳統中藥材，在各種心血管病的治療中均有廣泛應用。丹酚酸B是丹參主要有效水溶性成分，可抑制血小板聚集，抑制血栓形成[4]，但對MIRI影響的相關研究并不多見。本研究通過觀察丹酚酸B誘導血管新生對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護機制及凋亡相關蛋白質組學的影響，探討其可能的作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡SPF級SD健康雄性大鼠40只，體質量（200±20）g，由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK（京）2018-0011。飼養條件：溫度23～25℃，相對濕度50%～60%，自然光照，自由飲水、飲食。動物實驗經醫學實驗動物管理委員會批準，批準號：JN.No20191030b0480130，所有操作均嚴格遵循實驗動物管理相關規定。

1.2 藥物與試劑 丹酚酸B（批號：201523，上海一基實業有限公司）；培哚普利片（批號：201108，法國Les Laboratoires Servier Industrie公司）；水合氯醛（批號：20151205，美國Sigma-Aldrich公司）；血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）ELISA試劑盒（批號：20180519）、前列腺素（prostacyclin，PGI2）ELISA試劑盒（批號：20180735）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA試劑盒（批號：20190238）（上海聯碩生物科技有限公司）；B細胞淋巴瘤/白血病2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（批號：20191228）、B細胞淋巴瘤/白血病2關聯（Bax）（批號：20181232）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）（批號：20190128）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）（批號：20190517）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號：20190505）（上海酶聯生物）；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（批號：20181010，北京索萊寶科技有限公司）；熒光上樣緩沖液（SDS-PAGE）（批號：201917，美國EZBiolab公司）。

1.3 主要儀器SAR-830-P型小動物呼吸機（美國CWE公司）；WHL-30B型電熱恒溫干燥箱（廣東佛衡儀器有限公司）；ECGenie型動物無創心電圖分析系統（美國Mouse Specifics Inc公司）；SW-CJ-2D型超凈工作臺（北京華威興業科技有限公司）；DMD108型光學顯微鏡（德國徠卡公司）；AVANTI J-15R型高速冷凍臺式離心機（美國Beckman Coulter公司）；OmegaLum C型化學發光凝膠成像系統（美國Aplegen公司）；DYCZ-24DN型迷你雙垂直電泳儀（槽）（北京六一生物科技有限公司）；NanoDrop型微量分光光度計（美國Thermo Scientific公司）。

1.4 分組與給藥[5]將40只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、培哚普利組和丹酚酸B組，每組10只。培哚普利組大鼠腹腔注射培哚普利片溶液，0.4 mg/kg；丹酚酸B組大鼠腹腔注射丹酚酸B溶液，50.0 mg/kg[5]；模型組和假手術組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模前3 d開始給藥，1次/d，造模完成后停止給藥。

1.5 造模方法 假手術組大鼠僅開胸分離左冠狀動脈前降支，不進行血流阻斷和再灌注處理；其余大鼠建立MIRI模型，具體操作：10%水合氯醛麻醉，采用多導生理記錄儀進行心電圖監測，氣管插管連接小動物呼吸機；左側第三、四肋間切開皮膚，逐層分離后打開胸腔，充分暴露心臟；左心耳根部下方3～4 mm處進針，向肺動脈圓錐方向出針，將15 mm聚乙烯管置于結扎結下，收緊結扎線阻斷左冠狀動脈前降支血流。手術嚴格執行無菌操作，過程中監控大鼠心率、呼吸變化。以心電圖顯示ST段抬高或T波高聳為結扎成功，心肌缺血0.5 h后剪段結扎線；再灌注2 h后恢復冠脈血流，抬高的ST段降低1/2以上為MIRI造模成功。

1.6 實驗取材與處理 各組大鼠灌注2 h后即刻經大鼠腹主動脈取血漿，離心分離后取上清液保存待檢；取血后采用斷頭法處死大鼠，無菌條件下取出心臟，經生理鹽水沖洗后重新阻斷左冠狀動脈前降支并從頸動脈注入1%伊文思藍2 mL，分離左心室組織，濾紙吸干后-20℃冰箱內保存10 min后，取出切成2 mm左右厚度的心肌組織切片；采用甲醛固定，置于液氮中，-20℃凍存。

1.7 觀察指標

1.7.1 心肌組織病理學觀察 取缺血心肌組織，戊二醛固定2 h后采用PBS清洗，石蠟包埋與切片；二甲苯脫蠟，梯度乙醇洗脫，加入蒸餾水后加入蘇木素和伊紅（HE）染色，無水乙醇脫水后使用中性樹膠封固，于光學顯微鏡下拍照、觀察。

1.7.2 ELISA法檢測大鼠血清中VEGF、TAX2、PGI2水平 酶標板上預設定6個標準品孔、待測樣品孔和空白孔；經加樣、配液、洗滌、顯色、終止、測定等程序，根據標準品濃度和450 nm處吸光度計算回歸曲線，根據樣品的吸光度得到VEGF、TAX2、PGI2樣品濃度。所有過程均嚴格按照試劑盒說明書執行。

1.7.3 測定心肌梗死面積 將心肌組織置于PBS緩沖液（含1%TTC，pH值為7.4）中37℃水浴15 min，光學顯微鏡下觀察心肌組織。存活心肌表現為藍色，缺血心肌表現為紅色，梗死心肌表現為蒼白色。甲醛固定24 h后使用相機拍照，使用Image圖像分析軟件計算心肌梗死面積。

1.7.4 TUNEL法測定心肌細胞凋亡率 將心臟置于PBS溶液中，分離缺血區心肌，洗凈后采用甲醛固定，24 h后取出。用乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，按TUNEL試劑盒說明書步驟執行檢驗操作。染色后在光學顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，細胞核呈棕黃色為凋亡細胞。計算每100個細胞中凋亡細胞個數，計算細胞凋亡率。每個切片隨機選擇5個視野，取平均數。

1.7.5 Western blotting法測定Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表達 取10 mg各組大鼠心肌組織剪碎后加入RIPA裂解液和蛋白抑制劑，0℃水浴勻漿后轉移至預冷的1.5 mL EP管，充分裂解后，離心、分離棄置上清液；取少量蛋白質樣品采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，分光光度計比色，繪制標準蛋白曲線，經比色后得到蛋白質濃度，其余樣品-80℃凍存。采用10%SDS-PAGE凝膠，0.5%瓊脂糖封膠，進行垂直電泳槽電泳；PVDF轉膜，封閉后加入一抗液（1:1 000），4℃孵育過夜；次日采用PBS清洗3次，加入二抗（1:5 000），封口孵育2 h，PBS洗膜3次；加入到增強化學發光試劑中顯色5 min，曝光后檢測灰度值。以目標蛋白與GAPDH灰度值的比值作為Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax相對表達水平。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法檢驗。以P〈0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠死亡情況 假手術組大鼠手術過程中死亡3只；模型組大鼠造模過程中死亡2只，未達到MIRI標準2只；培哚普利組大鼠造模過程中死亡3只，未達到MIRI標準2只；丹酚酸B組大鼠造模過程中死亡1只，未達到MIRI標準3只。大鼠死亡原因主要是大出血和呼吸停止。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學改變情況 假手術組大鼠心肌細胞大小、形態正常，結構完整，未見梗死區域；模型組大鼠心肌結構不完整，細胞界限不清晰，細胞核脫落，可見炎性浸潤；培哚普利組和丹酚酸B組大鼠心肌組織病理學改變情況較模型組有明顯改善，結構較完整，大小、形態相對正常。（見圖1）

圖1 各組大鼠心肌組織病理學改變比較（HE，×400）

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較 模型組大鼠心肌組織總面積、心肌組織梗死面積、梗死面積比例均高于假手術組（P〈0.05）；培哚普利組、丹酚酸B組大鼠心肌組織梗死面積、梗死面積比例均低于模型組（P〈0.05）；丹酚酸B組大鼠心肌組織總面積、心肌組織梗死面積、梗死面積比例與培哚普利組比較，差異均無統計學意義（P〉0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較（±s）

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較（±s）

注：與假手術組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）總面積（cm2）梗死面積（cm2）梗死面積比例（%）假手術組 7 - 4.96±0.22 0 0模型組 6 - 5.45±0.30a 1.25±0.18a 22.94±5.12a培哚普利組5 0.4 5.38±0.27 0.83±0.14b 15.43±4.40b丹酚酸B組 6 50.0 5.35±0.29 0.86±0.15b 16.07±4.15b F 4.433 12.595 4.757 P 0.015 0.000 0.027

2.4 各組大鼠心肌凋亡率比較 假手術組大鼠未見明顯心肌細胞凋亡，模型組大鼠心肌細胞凋亡明顯，培哚普利組和丹酚酸B組大鼠與模型組比較有所改善，但仍見少量凋亡細胞。（見圖2）模型組大鼠心肌細胞凋亡率高于假手術組（P〈0.05）；培哚普利組、丹酚酸B組大鼠心肌細胞凋亡率低于模型組（P〈0.05）；丹酚酸B組大鼠心肌細胞凋亡率與培哚普利組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表2）

圖2 TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡情況（×100）

表2 各組大鼠心肌凋亡率比較（±s，%）

表2 各組大鼠心肌凋亡率比較（±s，%）

注：與假手術組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg） 細胞凋亡率假手術組 7 - 0.31±0.04模型組 6 - 43.65±5.82a培哚普利組 5 0.4 20.18±1.65b丹酚酸B組 6 50.0 21.45±1.82b F 205.761 P 0.000

2.5 各組大鼠血清中VEGF、TAX2、PGI2含量比較 模型組大鼠血清中VEGF、PGI2含量低于假手術組（P〈0.05），TAX2含量高于假手術組（P〈0.05）；培哚普利組和丹酚酸B組大鼠血清中VEGF、PGI2含量高于模型組（P〈0.05），TAX2含量低于模型組（P〈0.05）；丹酚酸B組大鼠血清中VEGF含量高于培哚普利組（P〈0.05），TAX2含量低于培哚普利組（P〈0.05）；丹酚酸B組大鼠血清中PGI2含量與培哚普利組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清中VEGF、TAX2、PGI2含量比較（±s，ng/L）

表3 各組大鼠血清中VEGF、TAX2、PGI2含量比較（±s，ng/L）

注：與假手術組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與培哚普利組比較，cP〈0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）VEGF TAX2 PGI2假手術組 7 - 105.68±9.85 30.28±1.51 61.74±5.59模型組 6 - 35.16±5.12a 58.38±1.35a 35.62±5.18a培哚普利組 5 0.4 72.39±6.74b 44.52±1.43b 55.16±5.74b丹酚酸B組 6 50.0 85.96±6.82bc 39.81±0.96bc 50.34±5.37b F 99.534 481.547 25.834 P 0.000 0.000 0.000

2.6 各組大鼠心肌組織中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較 模型組大鼠心肌組織中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量高于假手術組（P〈0.05）；培哚普利組和丹酚酸B組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白相對表達量高于模型組（P〈0.05），Caspase-3、PI3K、Bax蛋白相對表達量低于模型組（P〈0.05）；丹酚酸B組大鼠心肌組織中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量與培哚普利組比較，差異均無統計學意義（P〉0.05）。（見表4、圖3）

圖3 各組大鼠心肌組織中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白電泳圖

表4 各組大鼠心肌組織中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較（±s）

注：與假手術組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動物數（只）給藥劑量(mg/kg)Caspase-3 PI3K Bcl-2 Bax假手術組 7 - 0.21±0.03 0.15±0.01 0.51±0.03 0.18±0.02模型組 6 - 0.68±0.10a 0.64±0.05a 0.70±0.05a 0.75±0.11a培哚普利組 5 0.4 0.35±0.04b 0.28±0.03b 0.83±0.10b 0.32±0.06b丹酚酸B組 6 50.0 0.38±0.05b 0.30±0.02b 0.85±0.09b 0.35±0.05b F 66.217 292.369 31.855 83.146 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討 論

冠狀動脈介入、冠狀動脈搭橋、溶栓等是臨床上治療急性心血管病的常用治療手段，可有效恢復心肌缺血細胞的血供，但MIRI的發生使其未達到預期療效。MIRI是心肌血供中斷一定時間后恢復血供造成的嚴重的損傷，會導致患者出現心功能不全、血壓驟降、心律失常等癥狀，導致病情惡化，甚至可能導致患者猝死。缺血預處理是通過短暫阻斷冠狀動脈血流對隨后較長時間的心肌缺血再灌注損傷產生保護作用，但目前的缺血預處理具有創傷性，會提高治療風險，很難在臨床中應用。因此，藥物性預處理的延遲性保護作用近年來逐漸成為研究的熱點。

中醫對于心血管疾病，尤其是缺血性心臟病以活血、化瘀、止痛為基本治療原則。丹參是我國傳統中藥材，具有活血祛瘀、通經止痛的功效[6]；丹酚酸B是丹參主要成分，可通過多種途徑發揮抗心肌缺血的作用[7]。本研究顯示，經丹酚酸B處理后的大鼠心肌組織梗死面積、梗死面積比例均降低（P〈0.05），且與培哚普利組比較，差異無統計學意義（P〉0.05），證實丹酚酸B能夠降低MIRI大鼠模型心肌損傷，對心肌細胞具有保護作用，與楊華等[8]研究結果具有一致性。盡管多種研究證實，丹酚酸B對機體損傷部位具有保護作用，但其具體機制尚未完全清楚。

完整的血管內皮細胞層在調控血管滲透性、血小板黏附等方面具有重要作用[9]。任何因素引起的內皮細胞受損都可能引起內皮功能障礙，而內皮功能障礙是心血管病疾病發生的關鍵因素[10]。MIRI發生后血管內皮功能損傷，導致心肌細胞能量代謝障礙，產生大量氧自由基。VEGF是一類同源二聚體糖蛋白，對促進微血管新生和成熟具有重要作用。VEGF及其受體可有效提高血管通透性，促進血管內皮細胞增殖、遷移，促進心血管的形成，并且廣泛參與細胞增殖、分化、抗炎、抗凋亡和促血管新生等過程[11]。TAX2和PGI2是前列腺素類重要因子，由花生四烯酸經環氧化酶催化形成，是調節血管壁緊張性的主要活性物質。TAX2常被用作血管收縮劑，可促進血小板聚集和血管收縮[12]。PGI2是血管保護因子，具有抑制血小板聚集、舒張血管、對抗TAX2的作用[13]。正常情況下，二者處于動態平衡，共同維護血管的穩定。一旦發生缺血缺氧致內皮細胞受損，就會導致TAX2釋放增多，PGI2生成減少，引起血管收縮，誘發冠狀動脈痙攣，同時提高血管通透性。本研究顯示，經丹酚酸B處理后的大鼠VEGF、PGI2含量升高（P〈0.05），TAX2含量降低（P〈0.05），證實丹酚酸B可促進微循環血管生成，改善內皮功能和冠狀動脈微循環障礙，對抗凝血和血栓的形成。

細胞凋亡是基因控制的細胞主動死亡過程，是機體發生的細胞生理性死亡現象，對生長、發育和維持機體內環境穩定具有重要作用。同時細胞凋亡也是導致血管內皮功能障礙的重要原因，30%～50%的內皮細胞死亡源于細胞凋亡。當機體遭受應激傷害時會啟動一系列的防御機制而產生保護作用。MIRI引起的乳酸、一氧化氮堆積等均會加速正常細胞的凋亡[14]。本研究中，經丹酚酸B處理后的大鼠心肌細胞凋亡率明顯降低（P〈0.05），證實丹酚酸B可有效抑制細胞凋亡。細胞凋亡過程由多種基因蛋白表達調控。細胞凋亡分為內源性凋亡和外源性凋亡兩種途徑。Bcl-2家族是細胞凋亡內源性線粒體通路的重要調節因子。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族主要成員，是早期被發現的參與細胞凋亡的蛋白，是反映心肌生存能力的重要指標[15]。Bcl-2是抑制凋亡蛋白，主要存在于細胞線粒體膜、核膜等，通過維持Ca2+的動態平衡抗拮促凋亡蛋白的表達；Bax是促凋亡蛋白，也是Bcl-2同源基因蛋白，通過抑制Bcl-2損傷線粒體，抑制線粒體信號通路啟動，從而促進細胞凋亡。MIRI會誘導細胞凋亡，阻斷啟動抗凋亡的信號通路。PI3K/Akt信號通路廣泛存在于真核細胞中，參與細胞激活，調控蛋白質代謝，可作用于Bcl凋亡家族。Caspase-3被稱為細胞凋亡的執行者，正常情況下，Caspase-3以酶原的形式在細胞質中存在，并不具備活性，在凋亡發生的早期階段被激活，裂解胞質、胞核底物，啟動細胞凋亡[16]。本研究顯示，模型組大鼠心肌組織中Caspase-3、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量高于假手術組（P〈0.05），證實上述凋亡蛋白在MIRI中均異常表達。經丹酚酸B處理后，心肌組織中Bcl-2蛋白相對表達量升高（P〈0.05），Caspase-3、PI3K、Bax蛋白相對表達量降低（P〈0.05），提示丹酚酸B可能通過抑制Caspase-3、PI3K、Bax蛋白，上調Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡。綜上所述，丹酚酸B對心肌缺血再灌注損傷的保護作用可能通過誘導血管新生、抗凋亡實現。