黃柏堿對LPS誘導小膠質細胞活化的抑制作用及其機制研究*

許孟秋，陸韻薇，易慧敏，于顧然

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

神經退行性疾?。╪eurodegenerative disease，ND）[1]是由于老年后中樞神經慢性進行性變性而產生的疾病，包括多發性硬化、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化等。目前ND已成為威脅人類健康的第三位疾病，僅次于心血管疾病、癌癥。研究[2-5]表明小膠質細胞的活化在上述疾病的發生、發展過程中扮演重要角色。

黃柏味苦性寒，能清熱燥濕，瀉火解毒，臨床上用于治療瀉痢、黃疸、帶下、淋證、骨蒸勞熱等?，F代研究[6-8]顯示，黃柏有多途徑抗炎作用。黃柏堿是《中華人民共和國藥典》中規定的黃柏的活性成分、質檢成分之一[9]。藥物代謝動力學表明大鼠注射黃柏堿（2 mg/kg）后，在腎臟中濃度最高，并可穿過血腦屏障[10]。研究表明，黃柏堿能通過抑制腎小球中巨噬細胞和細胞毒性T淋巴細胞的增殖或遷移的能力來發揮抗腎炎的作用[8]，還能通過阻滯自主神經節發揮降壓作用[11]。黃柏堿具有抑制細胞免疫[12-13]、抗氧化[14-15]、神經保護等作用[14]。黃柏有效成分之一小檗堿已被證明能抑制TLR-4表達，從而抑制小膠質細胞活化發揮神經保護作用[16]，并有研究顯示黃柏堿的免疫抑制[13]、抗氧化、神經保護作用[14]強于小檗堿，但黃柏堿對小膠質細胞活化的影響及其機制還未有研究涉及。本實驗通過LPS誘導小膠質細胞活化，建立神經炎癥模型，采用黃柏堿進行干預觀察其對小膠質細胞的作用并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 小膠質細胞BV2細胞株購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑DMEM/F-12高糖培養液（美國Gibco公司，批號：8119395）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：42A0378K）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Gibco公司，批號：8117157）；四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國Sigma公司，批號：M2128）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0015L）；NO試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：011020200601）；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（Sigma公司，批號：L2880）；誘導型一氧化氮合酶（iNOS）（美國Proteintech公司，批號：00080373）；環氧化酶-2（COX-2）（美國Proteintech公司，批號：10003388）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（美國Proteintech公司，批號：00077108）；Toll樣受體-4（TLR-4）（美國Proteintech公司，批號：10003388）；髓樣分化因子（MYD-88）（美國Proteintech公司，批號：10006278）；NF-κB p65抗體（美國Proteintech公司，批號：00084200）；二抗兔（福麥斯生物技術有限公司，批號：2635054）；二抗鼠（博士德公司，批號：BA1050）；ECL化學發光劑（Biosharp公司，批號：DCM70080100）；Resatorvid（美國MCE公司，貨號：HY-11109）；黃柏堿（成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-20052104）。

1.3 主要儀器AC2-4S1型生物安全柜（新加坡ESCO公司）；C150型CO2培養箱（德國BINDER公司）；CKX4I型三目倒置顯微鏡（美國Bio-rad公司）；ELX800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；DW FL450型低溫生物冰箱（中科美菱公司）；04313849512免疫印跡電泳及轉膜儀（美國Bio-rad公司）；CHEMZDOCX RS+型IMage Lab凝膠成像系統（美國Bio-Tek公司）；UCX-130型超聲波細胞破碎儀（美國SONICS公司）；MK10E型干式加熱型恒溫器（上海滬奧明公司）；BX43型正置熒光顯微鏡（日本OLMPUS公司）；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器（北京Vortex-Genie公司）；CFL-10002型恒溫水浴鍋（常州蒙特儀器公司）；Gen Pure Pro型超凈純水儀（美國Thermo公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養BV2細胞用內含10%胎牛血清、1%鏈霉素、兩性霉素及青霉素、90%DMEM/F-12高糖培養液置于37℃5%CO2培養箱中培養，待細胞長至鋪滿皿底90%時，用0.25%胰蛋白酶消化進行傳代，并選取對數生長期細胞進行實驗。

1.4.2 藥品配制 在無菌生物安全箱中操作，粉末狀20 mg的黃柏堿單體先用少量DMSO（保證使用濃度內96孔板中每孔DMSO質量分數＜1‰）溶解，再加入含血清的DMEM/F-12溶液稀釋成濃度為300 mmol/L黃柏堿單體溶液在-20℃冰柜中存儲備用。

1.4.3 造模濃度選擇及細胞分組 根據不同濃度脂多糖（LPS）在倒置相差顯微鏡下細胞形態變化及NO水平結果，以及查閱文獻[17-18]選取1 μg/mL脂多糖（LPS）作為造模濃度。

實驗分組：對照組、模型組（LPS 1 μg/mL）、抑制劑組（Resatorvid，TLR-4抑制劑終濃度為100 μmol/L+LPS 1 μg/mL）、黃柏堿低劑量組（黃柏堿終濃度100 μmol/L+LPS 1 μg/mL）、黃柏堿中劑量組（黃柏堿終濃度200 μmol/L+LPS 1 μg/mL）、黃柏堿高劑量組（黃柏堿終濃度300 μmol/L+LPS 1 μg/mL）。細胞按預設組鋪板孵育細胞長至鋪滿皿底80%時，棄去各組原培養液，更換新鮮培養基，在黃柏堿低、中、高劑量組內加入不同劑量黃柏堿、抑制劑（Resatorvid）預保護細胞2 h，后于模型組，抑制劑組及黃柏堿低、中、高劑量組內分別加入1 μg/mL LPS損傷24 h，最后進行各項指標檢測。

1.4.4 MTT法檢測黃柏堿、LPS、黃柏堿+LPS、抑制劑+LPS對BV2細胞活性的影響 選取培養至對數生長期的BV2細胞，用胰酶消化，離心重懸計數，混勻后鋪于96孔板中，每孔目標數取8×103個，每孔加入100 μL細胞混懸液，待細胞長至鋪滿皿底80%時進行實驗，吸出原培養液，加入不同濃度黃柏堿（10、50、100、200、300、500 μmol/L）或LPS（0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL）或“1.4.3”各組別，在LPS損傷24 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）繼續培養4 h，棄原培養液，加入150 μL DMSO，置振蕩儀上避光震蕩10 min，使用酶標儀測定OD490值，計算各組細胞存活率。細胞存活率（%）=處理組OD值/空白組OD值×100%。

1.4.5 倒置相差顯微鏡下觀察各組BV2的形態變化 選取培養至對數生長期的BV2細胞，用胰酶消化，離心重懸計數，混勻后鋪于96或12孔板后，按照不同分組加入不同質量濃度LPS（0.1、0.2、0.5、1.5 μg/mL）或“1.4.3”各組別，實驗前后用倒置相差顯微鏡（×400）下觀察各組小膠質細胞形態變化。

1.4.6 Griess法測定NO水平BV2細胞以1×105個/mL的密度接種于12孔板，1 mL/孔。待細胞貼壁后，設立對照組、不同質量濃度LPS（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL）組或“1.4.3”各組別。LPS刺激BV2細胞24 h后收集細胞上清。按50 μL/孔的標準，在酶標板中加入各組細胞上清及標準品，再向各孔加入已靜置到室溫的50μL Griess ReagentⅠ和50μL Griess ReagentⅡ。振蕩混勻后避光反應10 min，酶標儀測定吸光度OD540值。樣品中NO含量根據測得的標準曲線確定。各組NO水平=處理組/空白組。

1.4.7 Western blotting法檢測炎癥及通路相關蛋白表達 將細胞接種于培養皿中，分組及藥物處理同“1.4.3”，待LPS損傷24 h后取出培養皿置冰上，用4℃的PBS洗3次，每次均吸盡清洗液，后加入100 μL蛋白裂解液（蛋白酶抑制劑∶RIPA原液∶磷酸酶抑制劑∶PMSF=1∶1 000∶10∶10）充分裂解15 min，將裂解后的混懸液移至1.5 mL EP管內行超聲裂解3次，15 s/次，將EP管置于預冷4℃的離心機12 000 r/min離心15 min，取上清液并加入5×SDS上樣緩沖液，高溫蛋白變性10 min，以BCA蛋白濃度測定法測蛋白濃度，進行蛋白電泳并轉膜，將PDVF膜在室溫下置于5%的脫脂奶粉中搖床封閉1 h，剪膜后將各條帶置于一抗中4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，室溫下搖床孵育二抗1 h，TBST洗膜10 min×3次，采用ECL化學發光法曝光顯影，使用Image Lab軟件進行圖像分析。

1.4.8 免疫熒光法檢測黃柏堿對LPS誘導BV2細胞iNOS、NF-κB（p65）的表達及核定位情況 將圓形蓋玻片用75%酒精浸泡過夜，紫外線消毒30 min，放入12孔板內。把BV2細胞懸浮液按10×104個/孔接種于12孔板內的蓋玻片上，2 mL/孔，設置對照組，模型組，抑制劑組和黃柏堿低、中、高劑量組。細胞貼壁后棄上清，按照分組加入黃柏堿或抑制劑6 h，再加1 μg/mL LPS刺激12 h，用4%多聚甲醛固定30 min，加入1%Triton破膜30 min，每孔加入免疫熒光封閉液封閉1 h，一抗4℃過夜，室溫復溫1 h，二抗常溫避光1 h，DAPI染色5 min，抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下采集圖片。使用Image J軟件進行圖像分析。

1.5 統計學方法 運用SPSS 26.0和GraphPad Prim軟件對數據進行分析和作圖，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，數據經檢驗均服從正態分布，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。上述實驗均重復3遍以上。

2 結 果

2.1 MTT法檢測黃柏堿、LPS、黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞活性的影響 各濃度黃柏堿組BV2細胞活性與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。（見圖1）各濃度LPS組BV2細胞活性與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。（見圖2）各濃度黃柏堿+LPS組BV2細胞活性與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見圖3）表明選取的不同濃度黃柏堿、LPS對細胞活性均無損傷作用。

圖1 不同濃度黃柏堿對BV2細胞活性的影響（±s，n=3）

圖2 不同濃度LPS對BV2細胞活性的影響（±s，n=3）

圖3 不同濃度黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞活性的影響（s，n=3）

2.2 不同濃度LPS、黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞形態的影響

2.2.1 不同濃度LPS對BV2細胞形態的影響 對照組小膠質細胞呈靜息狀態，胞體細長，胞體兩側伸出細長突起的分支，呈“分枝狀”；加入LPS刺激后，細胞大多數胞體變大、變圓，部分細胞表面突起變粗短，呈典型的“阿米巴狀”，尤其以LPS 1 μg/mL組、LPS 2 μg/mL組激活最充分。

圖4 不同濃度LPS對BV2細胞形態的影響（×400）

2.2.2 黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞形態的影響 對照組小膠質細胞呈未激活的“分枝狀”；經LPS 1 μg/mL刺激后，模型組細胞呈“阿米巴狀”；黃柏堿、抑制劑（resatorvid）預處理后細胞形態有改善，黃柏堿高劑量組、抑制劑組效果最好。（見圖5）

圖5 黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞形態的影響（×400）

2.3 不同濃度LPS、黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞NO水平的影響

2.3.1 不同濃度LPS對BV2細胞NO水平的影響 不同濃度LPS干預后，除LPS 0.1 μg/mL組外，其余各組BV2細胞的NO表達量均明顯高于對照組（P＜0.01），LPS 1 μg/mL組BV2細胞的NO表達量與LPS 2 μg/mL組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖6）

圖6 不同濃度LPS對BV2細胞NO水平的影響s，n=3）

2.3.2 黃柏堿/抑制劑+LPS對BV2細胞NO水平的影響LPS干預后，模型組BV2細胞NO表達量明顯高于對照組（P＜0.01）；黃柏堿預處理2 h后，各組BV2細胞NO表達量呈劑量依賴性降低，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），表明黃柏堿可抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞NO的釋放；黃柏堿低劑量組BV2表達量高于抑制劑組（P＜0.01）；黃柏堿中、高劑量組BV2細胞NO表達量與抑制劑組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖7）

圖7 黃柏堿/抑制劑對BV2細胞NO水平的影響（=3）

2.4 Western blotting法檢測炎癥及通路相關蛋白表達結果

2.4.1 Western blotting法檢測各組BV2細胞炎癥蛋白表達情況 模型組BV2細胞iNOS、COX-2、TNF-α表達明顯高于對照組（P＜0.01）；黃柏堿干預后，表達量呈劑量依賴性降低，黃柏堿高劑量組BV2細胞iNOS、TNF-α，以及黃柏堿低、中、高劑量組BV2細胞COX-2明顯均低于模型組（P＜0.01）；黃柏堿低、中、高劑量組BV2細胞iNOS、COX-2，以及黃柏堿高劑量組TNF-α與抑制劑組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖8）

2.4.2 Western blotting法檢測各組BV2細胞通路蛋白表達情況 模型組BV2細胞TLR-4、MYD-88、p65表達均明顯高于對照組（P＜0.01）；黃柏堿干預后表達量呈劑量依賴性降低，黃柏堿中、高劑量組BV2細胞TLR-4、MYD-88、p65表達均明顯低于模型組（P＜0.01）；黃柏堿中、高劑量組BV2細胞TLR-4、p65，以及黃柏堿高劑量組BV2細胞MYD-88表達與抑制劑組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖8）

圖8 Western blotting法檢測各組BV2細胞炎癥及通路相關蛋白表達情況s，n=3）

2.5 黃柏堿對LPS誘導BV2細胞iNOS、NF-κB（p65）的表達及核定位的影響

2.5.1 黃柏堿對LPS誘導BV2細胞iNOS表達的影響 對照組BV2細胞的iNOS為淡綠色，細胞核呈藍色。LPS刺激后，模型組BV2細胞的顏色加深；黃柏堿、抑制劑（resatorvid）預處理后，顏色變淺。熒光定量結果表明，LPS處理后，模型組BV2細胞iNOS熒光表達明顯高于對照組（P＜0.01）；黃柏堿干預后，BV2細胞iNOS熒光表達呈劑量依賴性降低，黃柏堿中、高劑量組BV2細胞iNOS熒光表達與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；黃柏堿高劑量組BV2細胞iNOS熒光表達與抑制劑組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖9～10）

圖9 各組iNOS熒光值比較s，n=3）

2.5.2 黃柏堿對LPS誘導BV2細胞活化NF-κB（p65）表達及核定位的影響 對照組BV2細胞的NF-κB（p65）聚集在胞漿中，淡紅色，細胞核藍色；LPS刺激后，模型組BV2細胞的NF-κB（p65）呈深紅色，熒光定量明顯高于對照組（P＜0.01），且大量進入細胞核（P＜0.01）；黃柏堿干預后，BV2細胞NF-κB（p65）熒光表達、核漿比呈劑量依賴性降低，黃柏堿中、高劑量組NF-κB（p65）熒光表達、核漿比明顯低于模型組（P＜0.05）；黃柏堿高劑量組BV2細胞NF-κB（p65）熒光表達、核漿比與抑制劑組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖11～12）

圖11 免疫熒光法檢測各組小膠質細胞NF-κB（p65）表達及核定位情況（×400）

圖10 免疫熒光法檢測各組小膠質細胞iNOS表達（×400）

圖12 各組小膠質細胞NF-κB（p65）表達及核漿比較s，n=3）

3 討 論

小膠質細胞是一種中樞神經系統內的單核巨噬細胞，占腦細胞總數的10%～15%。其功能主要有免疫監視、吞噬病原體、分泌細胞因子、抗原提呈及修復組織等。靜息時，胞體小，有伸向各個方向的突起，為“分枝狀”的小膠質細胞；在受到腦內不同信號刺激后，其轉變為激活型的小膠質細胞，胞體增大，突起變短、類似于“圓形”，此時的小膠質細胞不具有吞噬功能，其在一定條件下轉化后，呈“阿米巴狀”，擁有細胞吞噬功能，稱之為活化型小膠質細胞。活化的小膠質細胞形態不同，作用不同，通過向不同的方向極化來完成生物學功能，主要極化為兩種類型，即“經典活化”M1型和“替代活化”M2型。M1極化后介導的免疫炎癥反應在多種神經系統疾病的病理過程中扮演重要角色。LPS或者IFN-γ，使小膠質細胞向M1型極化，表達促炎性細胞因子；IL-4/IL-13使小膠質細胞向M2型極化，抑制炎癥和恢復體內平衡狀態。有研究表明，中藥可以通過多條通路來誘導向M2型極化[19]。

小膠質細胞與神經元之間關系微妙，可以保護神經元，亦能損傷神經元。在靜息狀態下，小膠質細胞可通過釋放神經生長因子營養神經元和膠質細胞，通過吞飲來清除中樞神經發育過程中的凋亡細胞和代謝產物以維持組織穩定；同時作為免疫細胞，小膠質細胞是中樞神經系統宿主抵御病原體的第一道防線，將健康組織與受損區域隔開。但是小膠質細胞的慢性激活、過度激活會通過釋放大量氧自由基及神經毒性因子，如一氧化氮（NO）、促炎細胞因子、活性氧中間體、趨化細胞因子等導致神經損傷[20]。其中，TNF-α能夠與神經元上的TNF受體結合，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）依賴的級聯反應，導致神經元凋亡，或促進谷氨酸釋放，增加興奮性毒性，此過程伴隨Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、核苷酸結合寡聚化樣受體（NLR）的激活，引起炎癥信號級聯反應，使誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環氧合酶-2（COX-2）等的表達增加，加重神經炎癥。故小膠質細胞與神經元之間聯系可能是通過TLR4/NF-κB通路實現的[21]。

體外實驗中，不同狀態的小膠質細胞由不同的潛在配體刺激得到。其中TLR激動劑，諸如LPS、IFN-γ可將小膠質細胞誘導活化，作為神經炎癥反應模型，也稱M1型。LPS為革蘭陰性菌外壁的組成部分，通過TLR4將信號轉導至細胞內，并通過兩種途徑，髓樣分化初級應答（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88）依賴性和MyD88非依賴性，激活NF-κB。TLR4是Toll樣受體家族（toll-like receptors，TLRs）的一員，Toll受體是Ⅰ型跨膜蛋白，它們可活化胞內信號分子，進而活化NF-κB，導致細胞黏附分子、IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和NO合成酶等基因的表達。

本研究中NO測定、Western blotting、免疫熒光實驗結果表明，黃柏堿可抑制由LPS誘導的BV2細胞活化，抑制NO的釋放，抑制iNOS、COX-2、TNF-α的表達，其作用可能是通過抑制TLR-4/MYD-88/NF-κB（p65）通路實現的，進而抑制炎癥因子分泌。這為臨床上應用黃柏治療中樞神經系統退行性疾病提供了實驗依據。