牛膝醇提物對實驗兔膝骨關節炎模型AMPK/Wnt/MAPK信號通路串話的影響*

馬篤軍，華樹良，彭力平，蔣順琬，曹亞飛，高 坤，王立新，莫益斌

（1.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東 深圳 518033；2.百色市人民醫院/右江民族醫學院附屬西南醫院，廣西 百色 533000；3.百色市人民醫院隆林分院，廣西 隆林 533499）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）以關節軟骨退行性變為核心病理改變，好發于中老年人[1]。近年來，膝關節OA在年輕人群中發病越來越多。OA致殘率高，對健康危害極大，給患者、家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔，目前尚無理想治療藥物[2]。前期研究表明牛膝對實驗兔OA模型關節軟骨損傷具有促進修復作用[3-4]，具體信號通路不清楚。信號通路可在分子水平上對疾病的發生、發展及治療機制進行解釋，而OA的發病機制涉及多種信號通路互作，不是局部或者單一發生作用，因此治療也應該從整體出發進行多通路互作研究[5]。故課題組擬深入研究探討牛膝有效成分醇提物對實驗兔膝OA模型腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/Wnt/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信號通路的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2～3個月齡普通級健康新西蘭大白兔64只，雌、雄各半，體質量（1.36±0.73）kg，購自廣東省實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK（粵）2019-0035。飼養環境：溫度20℃，濕度40%。于2019年1月至2019年12月在廣州中醫藥大學第四臨床醫學院中心實驗室、深圳市中醫藥研究所完成，獲得實驗動物倫理委員會批準，實驗操作符合2006年中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 藥物與試劑 牛膝醇提物（懷牛膝，廣州中醫藥大學第四臨床醫學院藥劑科制備，院內制劑）；10%甲醛標本固定液、環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox2）抗體（貨號：4842S）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抗體（貨號：9252S）、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）抗體（貨號：9102S）、P38抗體（貨號：9212s）（CST公司）；AMPK抗體（Lifespan公司，貨號：LS-B14414-50）；β-連環蛋白（β-catenin）抗體（Merck公司，貨號：MAB2081）；Tubulin抗體（Genetex公司，貨號：GTX11214）；蘇木素染料抗體（Servicebio公司，貨號：G1004）。

1.3 主要儀器EG11504型包埋機、ASP300S脫水機、EG1150C型冷卻臺、RM2235型切片機（Leica公司）；Mshot MF53型顯微鏡（廣州明美光電）；EPS-200型電泳儀、VE180C電泳槽、VE-586型轉膜槽（譽維生物）。

1.4 造模與分組 將64只實驗兔按照隨機數字表法分為造模組50只、空白對照組（未造模）14只，將實驗兔右膝關節用棉墊包裹好后于伸直位管型石膏固定制動6周，石膏外層纏繃帶[6]。每天監測生命體征、查看石膏固定松緊情況。造模6周后，從造模組和空白對照組各隨機抽取2只實驗兔進行膝關節比較，空氣栓塞法處死，從兔右膝髕骨內側縱行切開，行膝關節標本大體觀察，取脛骨平臺同一部位3mm×5 mm軟骨組織，留作病理HE染色，觀察組織結構。造模成功標準參照改良Mankin's評分標準[3]：關節表面出現不規則裂隙、軟骨基質染色減退、軟骨潮線結構不完整。造模成功后，將48只實驗兔隨機分為模型對照組、牛膝醇提物低劑量組、牛膝醇提物中劑量組、牛膝醇提物高劑量組，每組12只。

1.5 實驗給藥 懷牛膝在2015年版《中華人民共和國藥典》[7]人體常規最高用量為每日12 g，根據藥物試驗等效劑量換算，實驗兔每日用量約1 g/kg，牛膝醇提物每毫升醇提液相當于含原材料1 g。按照常規用藥量的1、3、6倍，分別予牛膝醇提物低、中、高劑量組實驗兔低、中、高劑量[1、3、6 mg/（kg·d）]牛膝醇提物灌胃，2次/d，每次灌胃時用蒸餾水配成15 mL，連續用藥6周?？瞻讓φ战M、模型對照組按照上述灌胃方法，予等量蒸餾水灌胃，15 mL/次，2次/d，連續6周。

1.6 觀察指標

1.6.1 軟骨組織病理學HE染色觀察 實驗兔連續灌胃6周后用過度麻醉處死實驗兔，然后用手鋸小心切取右膝脛骨平臺外側髁負重區同部位3 mm×5 mm軟骨組織，新鮮標本以10%中性甲醛溶液固定48 h，3%硝酸溶液脫鈣24～36 h，然后常規脫水、包埋，連續切片，厚4～5 μm，進行HE染色。

1.6.2 軟骨組織改良Mankin’s評分 軟骨組織HE染色后光鏡下觀察形態變化，采用改良Mankin’s法對關節軟骨結構、細胞、染色及潮線的完整性進行評分。評分標準見表1。

表1 切片關節軟骨組織學改良Mankin’s評分表

1.6.3 免疫組化檢測關節軟骨AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達 留取軟骨組織，新鮮標本以10%中性甲醛溶液固定48 h，然后常規脫水，石蠟包埋，連續切片，厚3～4 μm，留做免疫組化染色，測定AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達情況。具體操作步驟如下，石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15 min-二甲苯Ⅲ15 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min蒸餾水洗?？乖迯停航M織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復，中火8 min至沸，?；? min保溫再轉中低火7 min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次。阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育10 min，將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次。血清封閉：在組化圈內滴加5%山羊血清均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4℃孵育過夜。加二抗：一抗室溫復溫30 min，玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的二抗（HRP標記）覆蓋組織，室溫孵育50 min。DAB顯色：玻片置于PBS（pH=7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。復染細胞核：蘇木素復染5 min左右，自來水洗，蘇木素分化液分化數秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍，流水沖洗。脫水封片：將切片依次放入75%酒精5 min-85%酒精5 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。顯微鏡下采集圖像。藍色的為細胞核，棕色的為陽性點。

1.6.4 Western blotting檢測關節軟骨AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達 取軟骨組織剪碎后，加蛋白裂解液，用組織勻漿器研磨（加蛋白酶抑制劑1∶100+PMSF 1∶100+磷酸酶抑制劑1∶100）冰上裂解，4℃12 000 r/min離心15 min，離心半徑60 mm，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白量，水浴變性5 min，冷卻后上樣，跑膠，電轉，封閉，加入一抗：按照抗體說明書稀釋抗體，用5%BSA的TBST稀釋，4℃孵育過夜，TBST洗滌5次，加入二抗：按照兔1∶10 000，鼠1∶5 000稀釋抗體，TBST稀釋、洗滌，顯色：按1∶1配制發光液，覆蓋在膜表面，最后圖像采集分析。

1.6.5 AMPK/Wnt/MAPK信號通路關鍵蛋白相互作用網絡機制預測 根據https://string-db.org/網址預測繪制AMPK/Wnt/MAPK信號通路關鍵蛋白AMPK、Wnt、MAPK、ERK2、JNK（SAPK）、p38、COX-2、beta-catenin相互作用網絡機制圖。

1.7 統計學方法 采用SPSS25.0統計軟件分析，計量資料用“均數±標準差”（±s）表示。采用單因素方差分析，不滿足方差分析時用非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 造模6周后，未見實驗兔固定肢體出現壞死、褥瘡等表現，空白對照組兔膝關節表面光滑，造模組兔膝關節有骨質增生、不規則裂隙、關節面硬化等表現。（見圖1）造模過程未出現實驗動物死亡，灌胃過程中出現3只實驗兔死亡，其中模型對照組1只、牛膝醇提物中劑量組1只、牛膝醇提物高劑量組1只，造成實驗兔死亡原因主要考慮是灌胃操作不當，導致藥液灌入肺中造成窒息急性死亡。

圖1 兩組兔膝關節表面比較

2.2 各組兔軟骨組織病理學改變情況 空白對照組兔軟骨組織潮線結構、軟骨細胞形態、軟骨細胞排列紋理、基質染色等未見明顯改變。模型對照組兔軟骨組織血管入侵潮線結構，軟骨細胞數量明顯減少，軟骨細胞排列紋理、基質染色變淺。牛膝醇提物低、中、高劑量組兔局部軟骨表面可見不規則裂隙，達鈣化層，軟骨細胞數量增多，基質染色呈淺紅色，潮線結構稍正常，與劑量呈遞增趨勢。（見圖2）

圖2 各組兔軟骨組織病理改變（HE，×100）

2.3 各組兔膝關節病理學改良Mankin’s評分比較 模型對照組兔膝關節病理學改良Mankin’s評分明顯高于空白對照組（P＜0.01）；牛膝醇提物中、高劑量組兔膝關節病理學改良Mankin’s評分明顯低于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01），牛膝醇提物低劑量組兔膝關節病理學改良Mankin’s評分與模型對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組兔膝關節病理學改良Mankin’s評分比較

表2 各組兔膝關節病理學改良Mankin’s評分比較

注：與空白對照組比較，aP＜0.01；與模型對照組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

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2.4 各組兔膝關節軟骨AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達比較 免疫組化結果顯示，模型對照組兔膝關節軟骨ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達明顯高于空白對照組（P＜0.05），AMPK蛋白表達與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；牛膝醇提物低、中、高劑量組兔膝關節軟骨ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達明顯低于模型對照組（P＜0.05）；牛膝醇提物高劑量組兔膝關節軟骨AMPK蛋白表達明顯高于模型對照組（P＜0.05），牛膝醇提物低、中劑量組兔膝關節軟骨AMPK蛋白表達與模型對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組兔膝關節軟骨AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin表達比較）

Western blotting結果顯示，模型對照組兔膝關節軟骨ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達明顯高于空白對照組（P＜0.05），AMPK蛋白表達與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；牛膝醇提物低、中、高劑量組兔膝關節軟骨ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達明顯低于模型對照組（P＜0.05）；牛膝醇提物高劑量組兔膝關節軟骨AMPK蛋白表達明顯高于模型對照組（P＜0.05），牛膝醇提物低、中劑量組兔膝關節軟骨AMPK蛋白表達與模型對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖5）

圖5 各組兔膝關節軟骨組織AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin蛋白表達Western blotting檢測結果

2.5 AMPK/Wnt/MAPK信號通路關鍵蛋白相互作用網絡機制預測圖 在https://string-db.org/網址輸入AMPK/Wnt/MAPK信號通路AMPK、Wnt、MAPK、ERK2、JNK（SAPK）、p38、COX-2、β-Catenin關鍵蛋白，可以輸出關鍵蛋白之間相互作用網絡機制三級預測圖（來源：https://string-db.org/cgi/network.pl?taskId=qjKGQTZkskFu）。蛋白預測圖結果顯示，Akt家族蛋白節點最多，其次為Mapk家族蛋白節點，因此，Akt家族蛋白、Mapk家族蛋白在牛膝醇提物對AMPK/Wnt/MAPK信號通路網絡互作之間的聯系起了到關鍵橋接蛋白作用。（見圖6）

圖6 牛膝醇提物對AMPK/Wnt/MAPK信號通路關鍵蛋白相互作用網絡機制預測圖

圖4 各組兔膝關節軟骨組織AMPK、ERK、JNK、p38、COX-2、β-Catenin免疫組化圖（×100）

3 討 論

OA是臨床常見病，雖然手術治療OA發展迅速，如自身軟骨或軟骨細胞移植、關節置換等，但只適于極少數患者，藥物治療仍最常用[8]。但目前的藥物仍存在一定的副作用，有些制劑還處于探索研究階段，不能在臨床常規應用。因此如何恢復關節軟骨的完整性和正常功能，是目前OA研究的重點和難點[9]。

中醫藥治療骨關節炎有一定的優勢，中藥含有多種有效成分，可多途徑、多靶點發揮作用而提高療效。牛膝是在此類中藥中較為突出的一味，其主要有效成分包含黃酮類、甾酮類、多糖類、皂苷類等[10-12]?，F代藥理研究表明，黃酮類成分能抑制IL-6等炎癥因子的分泌，通過AMPK通路抑制NF-κB向細胞核轉移，導致細胞核內NF-κB的表達水平降低來抑制炎癥因子；甾酮類成分可借助激活ERK/MAPK信號通路途徑促進細胞增殖和細胞抗氧化作用；多糖類成分可通過上調Wnt-4、Frizzled-2、β-Catenin和cyclin D1的表達，下調GSK-3β的表達，激活Wnt/β-Catenin信號通路，促進Ⅱ型膠原的合成，達到軟骨保護作用；皂苷類成分能通過降低Wnt通路β-Catenin蛋白磷酸化來下調β-CateninmRNA的表達和抑制Wnt信號通路，下調TGF-β1表達發揮抑制系膜細胞增殖的作用。因此，AMPK/Wnt/MAPK信號通路串話可能是牛膝醇提物對OA軟骨修復作用的信號交互通路之一。

軟骨細胞生長、成熟受多因素的影響，多種細胞因子和信號轉導通路參與其中，組成了一個復雜多變的分子生物網絡系統[13]。AMPK、Wnt和MAPK信號傳導通路參與調節正常細胞生長、增殖、遷移、分化，調控正常組織重建，其發生異常改變與人類關節病變密切相關[14-15]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是細胞的能量感受器，在關節軟骨細胞中，AMPK能被異常激活，AMPK磷酸化的激活可促進mTOR、P13K減少細胞凋亡[16]。本研究免疫組化和Western blotting結果顯示牛膝醇提物能有效上調AMPK表達，說明牛膝醇提物具有減少軟骨細胞凋亡的能力。Wnt/β-Catenin通路是一種獨特的信號通路，可影響關節炎的發生、發展，主要是通過調節軟骨細胞的分化、增殖、凋亡，以及調節關節軟骨細胞外基質的合成與分解等而發揮調節作用，還可通過COX-2、IL、BMP2、MMPs、aggrecanases、RANKL/OPG比值變化來影響軟骨代謝[17]。前期實驗證實[4]，懷牛膝有效醇提物含藥血清在體外能有效地促進軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原蛋白表達及糖胺聚糖的分泌。陳達等[18]對兔OA模型用牛膝醇提物灌胃后發現，實驗組血液和關節液中IL-1β、TNF-α和MMP-3等炎癥介質的含量明顯低于空白對照組。目前的研究認為Wnt/β-Catenin信號通路是OA軟骨破壞病程中最重要的信號通路之一，與本實驗中軟骨組織免疫組化病理、Western blotting結果提示牛膝醇提物能降低COX-2、β-Catenin蛋白表達相符合，表明Wnt/β-Catenin通路可能是牛膝醇提物促進軟骨細胞增殖和抗凋亡的作用機制之一。MAPK是哺乳動物體內廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在OA病理過程中MAPK信號通路也參與并調節軟骨細胞的凋亡、肥大化、鈣化及增殖等生物學反應，例如當關節內炎癥因子增多時，可激活細胞內的MAPK信號轉導途徑，引起MMPs表達增加、軟骨細胞凋亡、軟骨破壞等一系列反應，其中MAPK家族參與了OA發病的有JNK、p38和ERK，在MAPK家族中ERK主要受生長因子的激活，而JNK/p38通路則主要受細胞外的應激，以及細胞因子和低氧因素刺激而活化，并且在對軟骨細胞的調節中3種亞型可以獨自或同時被激活。本實驗中ERK、JNK、p38蛋白在模型對照組高表達，在牛膝醇提物低、中、高劑量組表達依次呈降低趨勢，說明牛膝醇提物對MAPK信號通路具有一定抑制作用。String蛋白預測圖結果顯示Akt家族蛋白、Mapk家族蛋白在牛膝醇提物對AMPK/Wnt/MAPK信號通路網絡互作之間橋接蛋白節點最多，說明MAPK/AKT信號通路在牛膝醇提物治療OA中發揮了不可替代的作用，與報道相符[19-20]。

本研究觀察了牛膝醇提物對實驗兔膝關節OA模型AMPK/Wnt/MAPK信號網絡通路的影響，結果顯示牛膝醇提物能改善兔膝關節OA模型病理評分，有效上調AMPK通路AMPK蛋白表達，下調Wnt通路β-Catenin、COX-2蛋白，以及MAPK通路JNK、P38、ERK蛋白表達；蛋白互作網絡預測結果表明Akt家族蛋白、Mapk家族蛋白在牛膝醇提物對AMPK/Wnt/MAPK信號通路網絡互作之間的聯系起到了關鍵橋接蛋白作用，對證實牛膝治療膝骨關節炎具有重要的基礎理論意義，但具體的作用位點還需要深入研究。