基于Nrf2/HO-1通路探討藏紅花酸對高血脂合并冠心病大鼠心肌損傷的改善作用及對心電圖的影響*

李志坤，王希柱，宋巧鳳

（唐山市人民醫院，河北 唐山 063000）

冠心病是因冠狀動脈粥樣硬化或冠狀動脈功能改變引起的心肌缺血缺氧性心臟病，具有較高的發病率，成為造成人類死亡的主要疾病之一。高血脂是冠心病的獨立危險因素之一，其造成的血脂代謝障礙可加速動脈粥樣硬化的發展，引起冠狀動脈管腔堵塞或狹窄，進而發生心肌缺血、缺氧性壞死[1]。因此，改善血脂代謝、抑制心肌損傷是臨床重要治療措施。藏紅花酸是藏紅花的重要活性成分，具有抗氧化、改善微循環、抗凋亡等作用[2]。研究證實，藏紅花酸能夠改善大鼠局灶性腦缺血缺氧性損傷[3]。目前，關于藏紅花酸對缺血再灌注損傷方面的相關研究較多，在高血脂造成的心血管疾病方面研究較少。因此，本研究通過建立高血脂合并冠心病大鼠模型，分析藏紅花酸對大鼠心肌改善作用及對心電圖的影響，并探討其機制，以期為高血脂引起的冠心病治療提供更多選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物4周齡SPF級雄性SD大鼠55只，體質量180～220 g，購自廣州相觀生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（粵）2018-0043，在清潔級條件下（室溫22～24℃，相對濕度50%～70%，自由飲水進食）喂養1周后建立高血脂合并冠心病模型。本研究在實施前已經唐山市動物倫理委員會批準，實驗操作符合動物倫理委員會要求，倫理批號:20190212。

1.2 藥物與試劑 藏紅花酸（濟南浩化實業有限責任公司，純度＞98%，批號：190106）；消心痛（硝酸異山梨酯片，天津太平洋制藥有限公司，5 mg/片）；NRF2抑制劑ML385（上海澤葉生物有限公司，批號：181216）；兔抗大鼠核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2，Nrf2）多克隆抗體（批號：MA5-32116）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1，批號：MA5-32042）、B細胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）多克隆抗體（批號：MA5-33119）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）多克隆抗體（批號：MA5-36172）、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（批號：PA1-18329）（賽默飛世爾科技中國）。

1.3 主要儀器XR-RM-6280小動物心電圖機（上海欣軟信息科技有限公司）；OLympus光學顯微鏡（日本OLympus株式會社）。

1.4 造模與分組 參照文獻[4]建立高血脂合并冠心病大鼠模型，45只大鼠以高脂飼料（江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司）連續喂養8周，間隔24 h后予以腹腔注射垂體后葉素，30U/kg，1次/d，連續3次。末次腹腔注射后12 h進行心電圖檢查，以出現ST段移位或T波高聳為冠心病建模成功。心電圖檢測后采集眶靜脈血，離心分離血清，以生化分析儀檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）和（或）甘油三酯（triacylglyceride，TG）顯著升高為高血脂，同時符合高血脂及冠心病診斷者為建模成功。另10只大鼠正常普通飼料喂養8周，間隔24 h以0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，10 mL/kg，1次/d，連續3次，作為對照組。建模成功大鼠隨機分為模型組（11只）、消心痛組（10只）、藏紅花酸組（10只）、藏紅花酸+ML385組（10只）。

1.5 實驗給藥 垂體后葉素末次腹腔注射后24 h，藏紅花酸組大鼠給予藏紅花酸灌胃，50 mg/kg；藏紅花酸+ML385組大鼠給予藏紅花酸（50 mg/kg）+ML385（30 mg/kg）灌胃；消心痛組大鼠給予消心痛灌胃，2.5 mg/kg；對照組、模型組大鼠分別以0.5%羧甲基纖維素納灌胃，10 mL/kg，1次/d，連續4周，干預期間改為普通飼料飼養。

1.6 觀察指標

1.6.1 心電圖檢查 于末次給藥后6 h，大鼠以20%烏拉坦（5 mg/kg）腹腔注射麻醉，實施心電圖檢測，觀察肢體Ⅱ導聯心電圖，記錄各組大鼠ST段偏移幅度（mV）。

1.6.2 血脂指標檢測 心電圖檢測后，剪去心前區被毛，碘酒消毒，沿正中線切開胸部，暴露心臟，抽取4 mL血液，3 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，分離血清后使用生化分析儀及配套試劑檢測血脂[TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（hight density cipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density cipoprotein-cholesterol，LDL-C）]。

1.6.3 TUNEL染色觀察大鼠心肌細胞凋亡情況 抽血完畢后，各組選取5只大鼠過量麻醉處死，自上腔靜脈注入4%多聚甲醛至心臟變白，摘取心臟以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，細胞通透液通透，加入TUNEL反應液及DAPI染色，封片，光鏡下觀察心肌細胞凋亡情況，凋亡細胞褐色或棕黃色，隨機選取5個非重疊400倍視野，計算凋亡指數（AI），AI（%）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%。

1.6.4 Western blotting檢測心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量 心肌組織研磨勻漿，BCA法檢測蛋白濃度。30 μg蛋白樣品上樣于SDS-PAGE凝膠進行電泳，后轉移PVDF膜，加入1%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，洗膜后加入一抗，4℃封閉過夜，加入二抗室溫孵育60 min，加入曝光液，凝膠成像系統中曝光，Quantity One軟件分析電泳條帶灰度值，以灰度值與內參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件分析處理數據，計量資料采用“均數±標準差”（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心電圖ST段偏移幅度比較 模型組大鼠心電圖ST段偏移幅度高于對照組（P＜0.05）；消心痛組、藏紅花酸組大鼠心電圖ST段偏移幅度均低于模型組（P＜0.05），藏紅花酸+ML385組大鼠心電圖ST段偏移幅度與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；藏紅花酸組大鼠心電圖ST段偏移幅度高于消心痛組（P＜0.05）；藏紅花酸+ML385組大鼠心電圖ST段偏移幅度高于藏紅花酸組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠心電圖ST段偏移幅度比較±s，mV）

表1 各組大鼠心電圖ST段偏移幅度比較±s，mV）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與消心痛組比較，cP＜0.05；與藏紅花酸組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）ST段偏移幅度對照組 10 - 0.009±0.003模型組 11 - 0.098±0.006a消心痛組 10 2.5 0.035±0.004ab藏紅花酸組 10 50.0 0.068±0.005abc藏紅花酸+ML385組10 50.0+30.0 0.102±0.020acd F 171.938 P 0.000

2.2 各組大鼠血脂指標比較 模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均高于對照組，而HDL-C水平低于對照組（P＜0.05）；消心痛組、藏紅花酸組大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均低于模型組，而HDL-C水平均高于模型組（P＜0.05）；藏紅花酸+ML385組大鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C水平與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；藏紅花酸組大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均高于消心痛組，而HDL-C水平低于消心痛組（P＜0.05）；藏紅花酸+ML385組大鼠血清中TG、TC、HDL-C水平高于藏紅花酸組，而HDL-C水平低于藏紅花酸組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血脂指標比較s，mmol/L）

表2 各組大鼠血脂指標比較s，mmol/L）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與消心痛組比較，cP＜0.05；與藏紅花酸組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）TG TC HDL-C LDL-C對照組 10 - 0.60±0.10 1.55±0.42 1.12±0.10 0.82±0.08模型組 11 - 1.32±0.20a 4.55±0.80a 0.51±0.05a 3.85±0.20a消心痛組 10 2.5 0.82±0.15b 2.30±0.45b 0.90±0.08b 1.35±0.12b藏紅花酸組 10 50.0 1.05±0.10bc 2.88±0.61bc 0.70±0.06bc 1.80±0.15bc藏紅花酸+ML385組 10 50.0+30.0 1.35±0.15cd 4.42±0.75cd 0.52±0.05cd 3.76±0.18cd F 49.530 44.953 140.551 11.621 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較 模型組大鼠心肌細胞AI高于對照組（P＜0.05）；消心痛組、藏紅花酸組大鼠心肌細胞AI均低于模型組（P＜0.05）；藏紅花酸+ML385組大鼠心肌細胞AI與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；藏紅花酸組大鼠心肌細胞AI高于消心痛組（P＜0.05）；藏紅花酸+ML385組大鼠心肌細胞AI高于藏紅花酸組（P＜0.05）。（見表3、圖1）

表3 各組大鼠心肌細胞AI比較s，%）

表3 各組大鼠心肌細胞AI比較s，%）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與消心痛組比較，cP＜0.05；與藏紅花酸組比較，dP＜0.05

組別 細胞數（個） 心肌細胞AI對照組 25 5.01±1.20模型組 25 40.32±3.35a消心痛組 25 12.32±2.41b藏紅花酸組 25 16.87±3.00b c藏紅花酸+ML385組 25 39.35±3.20c d F 863.757 P 0.000

2.4 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較 模型組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量均低于對照組，而Bax蛋白相對表達量高于對照組（P＜0.05）；消心痛組、藏紅花酸組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量均高于模型組，而Bax蛋白相對表達量均低于模型組（P＜0.05）；藏紅花酸+ML385組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；藏紅花酸組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量低于消心痛組，而Bax蛋白相對表達量高于消心痛組（P＜0.05）；藏紅花酸+ML385組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量低于藏紅花酸組，而Bax蛋白相對表達量高于藏紅花酸組（P＜0.05）。（見表4、圖2）

表4 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較）

表4 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與消心痛組比較，cP＜0.05；與藏紅花酸組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）Nrf2 HO-1 Bcl-2 Bax對照組 5 - 0.92±0.12 0.98±0.10 1.08±0.12 0.10±0.02模型組 5 - 0.18±0.04a 0.15±0.04a 0.20±0.05a 0.55±0.05a消心痛組 5 2.5 0.60±0.06b 0.57±0.08b 0.85±0.10b 0.15±0.03b藏紅花酸組 5 50.0 0.50±0.05bc 0.40±0.05bc 0.61±0.08bc 0.22±0.04bc藏紅花酸+ML385組5 50.0+30.0 0.17±0.03cd 0.16±0.04cd 0.21±0.05cd 0.57±0.06cd F 107.152 133.450 105.552 114.122 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達圖

3 討 論

高血脂主要是因脂質代謝紊亂，引起內皮細胞、白細胞表面特異性改變，造成血管內皮損傷，血管腔逐漸變硬、狹窄，阻礙心肌供血，進而發生缺血、缺氧性壞死，可造成心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭及猝死，對患者的健康及生命安全均造成極大威脅[5]。因此，改善血脂代謝水平、抑制心肌細胞缺血缺氧性壞死成為冠心病的重要治療原則。

藏紅花酸是從鳶尾科植物番紅花花柱的上部及柱頭中提取的類胡蘿卜素物質，具有多不飽和共軛烯酸結構，有改善血脂、抗血小板聚集、抗細胞凋亡及改善血液循環等多種作用，能保護視網膜神經上皮細胞和肺細胞[6-7]。研究發現，藏紅花酸能抑制巨噬細胞源性泡沫細胞的形成，降低氧化低密度脂蛋白水平，發揮抗動脈粥樣硬化的作用[8]。另有研究發現，藏紅花酸可改善視網膜、胃和全腦缺血再灌注損傷，抑制細胞凋亡[9]。上述研究說明藏紅花酸有改善血脂代謝、抗動脈粥樣硬化和減輕缺血性細胞損傷的作用。本研究結果表明，模型組大鼠ST段偏移幅度，TG、TC、LDL-C水平，以及心肌細胞AI均高于對照組，HDL-C水平低于對照組，提示模型組存在高血脂及冠心病表現；消心痛組、藏紅花酸組大鼠心電圖ST段偏移幅度，血清中TG、TC、LDL-C水平，以及心肌細胞AI低于模型組，HDL-C水平高于模型組；藏紅花酸+ML385組大鼠心電圖ST段偏移幅度，血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C水平，以及心肌細胞AI與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。藏紅花酸組大鼠心電圖ST段偏移幅度，血清中TG、TC、LDL-C水平，以及心肌細胞AI均高于消心痛組，HDL-C水平低于消心痛組；藏紅花酸+ML385組大鼠心電圖ST偏移幅度，血清中TG、TC、LDL-C水平，以及心肌細胞AI均高于藏紅花酸組，HDL-C水平低于藏紅花酸組，證實藏紅花酸可改善高血脂合并冠心病大鼠血脂代謝，減輕心肌損傷，改善心電圖結果，抑制心肌細胞凋亡。

Nrf2是氧化應激反應的中樞調節因子，被激活后可向核內轉移啟動下游信號通路，發揮抗氧化應激作用[10]。HO-1是血紅素加氧酶的同工酶，能被各種氧化應激因子激活，增強細胞的抗氧化應激損傷能力，發揮抗炎、抗凋亡的作用[11]。研究證實，在氧化應激作用下，Nrf2被激活可誘導下游HO-1通過抗氧化應激作用抑制細胞凋亡，發揮心血管保護作用[12]。Bcl-2與Bax是同源二聚體的細胞凋亡調節基因，Bax位于細胞漿中，具有促進細胞凋亡作用。Bcl-2位于線粒體膜上，能通過維持線粒體膜的穩定性，抑制細胞凋亡，并與Bax形成二聚體抗Bax的凋亡作用[13-14]。劉中等[15]研究發現Bcl-2的表達上調及Bax表達下調可改善缺血預處理誘導的外泌體對心肌細胞低氧/復氧損傷修復作用。模型組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量均低于對照組，Bax蛋白相對表達量高于對照組；消心痛組、藏紅花酸組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量均高于模型組，而Bax蛋白相對表達量低于模型組；藏紅花酸+ML385組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；藏紅花酸組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量低于消心痛組，而Bax蛋白相對表達量高于消心痛組；藏紅花酸+ML385組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白相對表達量低于藏紅花酸組，而Bax蛋白相對表達量高于藏紅花酸組，提示藏紅花酸可能通過激活Nrf2/HO-1通路，發揮改善高血脂合并冠心病大鼠的血脂代謝和心電圖結果，抑制心肌損傷與凋亡的作用。

綜上所述，藏紅花酸能改善高血脂合并冠心病大鼠的血脂代謝水平，減輕心肌損傷，改善心電圖檢查結果，抑制心肌細胞凋亡，其機制可能與Nrf2/HO-1通路的激活有關。藏紅花酸對高血脂合并冠心病引起的心肌損傷有明顯的保護作用。