小檗堿對烏拉坦誘導的肺癌模型小鼠PI3K/AKT信號通路的作用研究

謝育霞，姚志雪，黃文緋，曹羅元

（1.寧德師范學院附屬寧德市醫院，福建 寧德 352100；2.寧德市閩東醫院，福建 寧德 352000）

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，其發病率和死亡率均高，其中85%的患者患有非小細胞肺癌[1]。肺癌的常規治療方法以手術、放射治療、化療和支持性護理（包括臨終護理）為主，多數患者的預后和生活質量較差，術后腫瘤復發率及轉移率高，易產生多藥耐藥，尋找新的預防和治療肺癌的藥物是當前肺癌臨床治療亟待解決的關鍵問題[2-3]。小檗堿是中藥黃連的主要有效成分，研究證明，黃連除了具有抗菌、抗炎作用外，同時具有顯著的抗癌作用，對肝癌、結腸癌、食管癌、白血病等多種惡性腫瘤有抑制作用[4]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinase B，Akt）信號通路與腫瘤細胞的生長繁殖、代謝和機體免疫應答有著緊密的聯系，調節該信號通路關鍵蛋白的表達可能成為治療腫瘤的新途徑[5]。本研究采用烏拉坦誘導小鼠肺癌模型，以PI3K/AKT信號通路為切入點探究小檗堿對烏拉坦誘導的肺癌預防作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡SPF級ICR小鼠120只，雌雄各半，體質量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。許可證號：SCXK（京）2017-0011。實驗小鼠在標準實驗室內飼養，飼養條件：室溫（22±2）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，保持12 h∶2 h光暗照明，食水不限。取血后麻醉處死全部實驗小鼠。此實驗經醫學實驗動物管理委員會批準，批準號：NDSYY-2018043。

1.2 藥物與試劑 小檗堿（上海一基實業有限公司，純度＞98%，批號：2086-83-1）；順鉑（批號：P4394）、烏拉坦（批號：P4394、U2500）（Sigma-Aldrich）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號：G1121）、中性樹膠（批號：G8590）、DAB顯色試劑盒（批號：DA1010）（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白定量試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限公司，批號：BCA01）；癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）ELISA試劑盒（批號：E-EL-M0232c）、癌抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）ELISA試劑盒（批號：E-EL-H0636c）（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；N-cadherin兔源單克隆抗體（批號：13116）、E-cadherin兔源單克隆抗體（批號：14472）、PI3K兔源單克隆抗體（批號：4249）、AKT兔源單克隆抗體（批號：4685）、磷酸化AKT（phospho-AKT，p-AKT）兔源單克隆抗體（批號：4060）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源單克隆抗體（批號：5174）、羊抗兔二抗（批號：7074）（美國CST公司）。

1.3 主要儀器YLS-1A型多功能小鼠自主活動記錄儀（安徽正華生物儀器設備有限公司）；AE223型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；RM2245型切片機（德國徠卡）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；G:BOX型多功能凝膠成像系統（Syngene）；Multiskan MK3型酶標儀（Thermo Fisher Scientific）；IX53型顯微鏡（日本奧林巴斯）；TGL16MB型高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）。

1.4 造模與分組 將小鼠隨機分為空白組，模型組，順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組，每組20只。除空白組外，其余各組小鼠給予烏拉坦溶液（600 mg/kg）腹腔注射，每周注射1次，持續10周，造模結束后通過直接觀察肺組織形態及肺組織病理切片確定造模是否成功，若肺組織表面出現明顯的腫瘤結節或肺組織HE染色切片出現明顯的核濃染、細胞密集增生及瘤區存在，證明造模成功[6]。

1.5 實驗給藥 根據前期預實驗結果，順鉑組小鼠腹腔注射2 mg/kg順鉑，每周3次，小檗堿高、中、低劑量組小鼠分別灌胃給予150、100、50 mg/（kg·d）的小檗堿，空白組和模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，所有小鼠連續給藥19周。

1.6 觀察指標

1.6.1 生理指標記錄與樣本采集 實驗期間記錄各組小鼠的體質量、自主活動情況（使用小動物自主活動儀測出的5 min內小鼠的活動次數），每兩周1次。給藥至第19周時，對小鼠摘眼球取血，血清在4℃冰箱中靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，置-80℃環境中保存；取小鼠肺組織，生理鹽水清洗至無血絲，計算肺癌發生率和肺部腫瘤結節數并取平均值（肺癌發生率=荷瘤鼠數/檢測鼠數×100%；肺部腫瘤結節數=檢測鼠肺結節數總和/檢測鼠數）。

1.6.2 HE染色檢測肺組織病理變化 取小鼠肺組織，置4%多聚甲醛中固定48h，清洗后置于不同濃度的酒精中梯度脫水、制作肺組織蠟塊并作組織切片（厚度為4 μm）。組織切片置于載玻片上，使用試劑盒進行HE染色，封片后置于顯微鏡下觀察肺組織病理變化情況。

1.6.3 ELISA法檢測血清CEA和CA125含量 取待測血清加入反應孔，每孔100 μL，每組設4個復孔，37℃孵育90 min，棄掉孔內液體，加入100 μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，棄掉孔內液體，洗滌3次，加入100 μL酶結合物工作液，37℃孵育30 min后棄掉孔內液體，洗滌5次，加入90 μL底物溶液，37℃孵育15 min，加50 μL終止液，450 nm波長下檢測，按照標準曲線計算各組小鼠血清CEA、CA125的含量。

1.6.4 免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達水平 肺組織樣本的采集和病理切片的制作同“1.6.2”。肺組織切片在二甲苯中脫蠟，置于梯度濃度的乙醇溶液中復水，隨后進行修復抗原、封閉、4℃孵育一抗12 h，37℃孵育二抗0.5 h，沖洗后加DAB顯色液，蘇木精染細胞核，最后脫水、封片，置于顯微鏡下觀察。

1.6.5 免疫印跡法（Western blotting，WB）檢測PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平 將小鼠肺組織剪碎后冰上研磨，離心取沉淀，沉淀中加入裂解液，提取肺組織蛋白，測定蛋白的濃度，隨后進行凝膠電泳，轉膜、封閉后置于PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶2 000）和p-AKT（1∶1 000）兔源一抗稀釋液中，4℃環境下孵育12 h，第2天用TBST緩沖液清洗，37℃環境下加入羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育2 h，清洗后用加ECL發光液，置于凝膠成像系統顯影。免疫印跡實驗的內參蛋白為GAPDH，用Image J軟件分析各個蛋白對應的灰度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.7 統計學方法 應用SPSS 25.0軟件對實驗數據進行統計分析，GraphPad Prism 8.0作圖。計量資料以“均數±標準差”）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠體質量比較6組小鼠的體質量均增加，模型組和順鉑組呈前期體質量增加，后期呈緩慢下降趨勢；與模型組比較，小檗堿高、中、低劑量組小鼠體質量均增加，以小檗堿中劑量組的小鼠體質量增加最顯著；除空白組外，其余各組小鼠的自主活動均呈下降趨勢，與模型組比較，小檗堿中劑量組小鼠自主活動下降較少，趨于穩定，以上指標差異均有統計學意義（P＜0.05）。（見圖1～2）

圖1 各組小鼠體質量比較±s，n=20）

圖2 各組小鼠自主活動比較，n=20）

2.2 各組小鼠肺癌發生率和肺部腫瘤結節數比較 順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠肺癌發生率和肺腫瘤結節數均低于模型組（P＜0.05）；小檗堿中、低劑量組小鼠肺癌發生率和肺腫瘤結節數均高于順鉑組（P＜0.05）；小檗堿高劑量組小鼠肺癌發生率和肺腫瘤結節數與順鉑組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠肺癌發生率和肺腫瘤結節數比較

表1 各組小鼠肺癌發生率和肺腫瘤結節數比較

注：與模型組比較，aP＜0.05；與順鉑組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）肺癌發生率（%）肺腫瘤結節數（個）空白組 20 - - -模型組 20 - 100 36.00±2.21順鉑組 20 2 33.12±1.45a 8.10±1.58a小檗堿高劑量組 20 150 32.25±1.02a 8.31±1.79a小檗堿中劑量組 20 100 45.36±1.22a b 15.66±2.08a b小檗堿低劑量組 20 50 63.67±1.51a b 19.14±2.07a b

2.3 各組小鼠肺組織病理學形態比較 空白組小鼠肺組織完好，無增生和炎癥細胞浸潤現象；模型組小鼠肺組織出現較多核濃染、細胞密集增生現象，肺組織腫脹，肺泡正常形態消失，存在大面積瘤區；順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠肺組織形態有明顯改善，肺組織結構基本清晰，較少出現細胞核密集增生和炎癥細胞浸潤情況，不同劑量小檗堿的作用呈明顯劑量依賴性。（見圖3）

圖3 各組小鼠肺組織病理變化情況（HE，×400）

2.4 各組小鼠血清CEA和CA125含量比較 模型組小鼠血清CEA和CA125含量均高于空白組（P＜0.05）；順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠血清CEA和CA125含量均低于模型組（P＜0.05），小檗堿中、低劑量組小鼠血清CEA和CA125含量均高于順鉑組（P＜0.05），小檗堿高劑量組小鼠血清CEA和CA125的含量與順鉑組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠血清CEA和CA125含量比較（x±s）

2.5 各組小鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin蛋白表達水平比較 與空白組比較，模型組小鼠肺組織N-cadherin蛋白陽性細胞百分比明顯升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白陽性細胞百分比明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠肺組織N-cadherin蛋白陽性細胞百分比降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白陽性細胞百分比升高（P＜0.05），且呈明顯劑量依賴性。與順鉑組比較，小檗堿中、低劑量組小鼠肺組織N-cadherin蛋白陽性細胞百分比升高（P＜0.05），E-cadherin蛋白陽性細胞百分比降低（P＜0.05）；小檗堿高劑量組小鼠肺組織N-cadherin和E-cadherin蛋白陽性細胞百分比與順鉑組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表3、圖4）

圖4 各組小鼠肺組織N-cadherin和E-cadherin蛋白表達水平比較（免疫組化，×400）

表3 各組小鼠肺組織N-cadherin和E-cadherin蛋白陽性細胞百分比比較s，%）

表3 各組小鼠肺組織N-cadherin和E-cadherin蛋白陽性細胞百分比比較s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與順鉑組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量（mg/kg）N-cadherin E-cadherin空白組 20 - 5.36±1.12 71.15±4.27模型組 20 - 65.26±3.57a 8.27±1.21a順鉑組 20 2 10.19±1.56a b 63.24±3.96a b小檗堿高劑量組20 150 12.45±2.14a b 69.24±4.18a b小檗堿中劑量組20 100 26.77±2.89a b c 40.58±3.17a b c小檗堿低劑量組20 50 42.84±3.11a b c 21.91±1.93a b c

2.6 各組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達比較 與空白組比較，模型組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，順鉑組和小檗堿高、中、低劑量組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。小檗堿中、低劑量組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達量均高于順鉑組（P＜0.05）；小檗堿高劑量組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達量與順鉑組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見圖5、表4）

圖5 各組小鼠肺組織中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達Western blotting圖

表4 各組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達量比較

表4 各組小鼠肺組織PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達量比較

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與順鉑組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）PI3K AKT p-AKT空白組 20 - 0.18±0.04 0.15±0.06 0.16±0.05模型組 20 - 0.95±0.09a 0.98±0.10a 0.99±0.12a順鉑組 20 2 0.25±0.04a b 0.24±0.04a b 0.25±0.03a b小檗堿高劑量組20 150 0.26±0.07a b 0.26±0.06a b 0.29±0.04a b小檗堿中劑量組20 100 0.45±0.05a b c 0.43±0.05a b c 0.49±0.07a b c小檗堿低劑量組20 50 0.69±0.07a b c 0.82±0.09a b c 0.85±0.09a b c

3 討 論

目前，肺癌是世界上最常見的癌癥，惡性程度高、易轉移、易產生耐藥性，西醫療法可在一定程度上殺傷癌細胞，但其不良反應嚴重影響患者生存質量和預后，因此，尋找有效的肺癌預防與治療藥物是當前肺癌臨床研究的關鍵[7-8]。研究顯示，多種中藥活性成分具有較好的抗腫瘤作用[9-12]。小檗堿是一種源于黃連的生物堿，已有多項研究證明小檗堿具有顯著的抗癌活性，然而小檗堿對烏拉坦誘導的小鼠肺癌的作用及機制仍有待闡明[13-14]。

本研究建立了烏拉坦誘導小鼠肺癌模型，結果顯示，與模型組比較，小檗堿可顯著改善肺癌小鼠的生存質量，降低烏拉坦誘導的小鼠肺癌發生率和肺部腫瘤結節數。其中，模型組，順鉑組和小檗堿高、低劑量組小鼠出現飲食減少，毛色無光澤，精神萎靡，自主活動下降的情況，而小檗堿中劑量組未出現此類現象，可能的原因是中劑量小檗堿為小鼠能夠適應的最佳治療劑量，在該劑量下，小鼠的生存質量最佳，肺癌發生率和肺腫瘤結節數能夠被顯著降低。肺組織病理切片結果顯示，小鼠肺組織結構基本清晰，較少產生核濃染、核畸變等癌變現象，血清CEA、CA125的含量顯著降低，且高劑量小檗堿作用與順鉑比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明小檗堿可抑制烏拉坦的誘癌作用。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程為腫瘤發生侵襲和遷移的一個特征，出現EMT轉化之后腫瘤細胞往往發生原位擴散，侵襲進入淋巴管和血管進而出現遠端轉移[15]。本研究結果顯示，小檗堿可顯著減少肺組織中N-cadherin蛋白表達水平，增加E-cadherin蛋白表達水平，抑制烏拉坦誘導肺癌EMT過程，其作用呈顯著劑量依賴性，小檗堿高劑量組小鼠肺組織N-cadherin蛋白和E-cadherin蛋白相對表達量與順鉑組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。這提示小檗堿具有良好的肺癌預防作用，可抑制肺癌的轉移和侵襲。PI3K/AKT信號通路是一種密切參與到細胞生長繁殖、運動、代謝和免疫應答調節的信號通路，同樣也參與到了多種疾病的發生與發展過程中，幾乎所有人類和動物腫瘤疾病中均發現了其被活化的現象[16-17]。PI3K/Akt信號通路主要通過其上游和下游的諸多分子來調控多種細胞生物過程，如PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/NF-κB等信號通路已被證明與腫瘤的增殖侵襲密切相關[18]。MENG X等[19]研究發現阿帕替尼通過干擾PI3K/Akt/mTOR信號通路可以誘導凋亡和自噬，從而可以作為治療難治性甲狀腺乳頭狀癌的潛在治療靶點。DUAN Y F等[20]通過體內、體外實驗研究發現巖藻聚糖可通過抑制PI3K/Akt相關蛋白的磷酸化產生對肝癌的抵抗作用。與上述研究一致，本研究結果顯示，與空白組比較，模型組小鼠肺組織PI3K/AKT信號通路被激活，PI3K、AKT、p-AKT的表達被顯著上調，而小檗堿則可顯著降低肺癌小鼠肺組織中PI3K、AKT、p-AKT的蛋白表達，呈劑量依賴性，小檗堿高劑量組與順鉑組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），表明小檗堿可抑制肺癌小鼠PI3K/AKT信號通路的活化。

綜上所述，小檗堿能夠改善烏拉坦誘導的肺癌模型小鼠生存質量和肺組織病理變化，降低肺癌小鼠血清腫瘤標志物CEA、CA125水平，抑制肺癌EMT過程，其機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路的活化有關。