龍葵銀消浸膏灌胃給藥BALB/c小鼠14天的毒性評價*

朱聰聰，潘會君，喻 琴，連天雁，朱全剛，沈 敏

（上海市皮膚病醫院，上海 200443）

銀屑病，中國古籍常稱為“白疕”“白癬”等，臨床用藥常以清熱涼血解毒為主[1-2]。龍葵銀消片（滬藥制字Z05020300）是我院的特色中藥制劑，由龍葵、鳳尾草、紫草、白芷、山藥5味中藥組成，具有清熱解毒、涼血祛風、匡扶正氣的功效，臨床用于治療尋常型銀屑病具有良好療效[3-4]，但尚未對該制劑進行安全性評價。現代藥理學研究表明，君藥龍葵含有的龍葵素，過度攝入輕者會出現惡心、嘔吐、頭暈、瞳孔放大等，重者可喪失知覺、休克，搶救不及時會導致死亡[5]；龍葵堿具有胚胎毒性，并有致畸、致突變作用[6]。為了探究該制劑可能的潛在毒性，本研究開展龍葵銀消浸膏連續灌胃給藥BALB/c小鼠14 d的潛在毒性研究，從而為臨床用藥提供參考。

1 材 料

1.1 藥物 龍葵（批號：190802）、鳳尾草（批號：190704）、白芷（批號：190823）、山藥（批號：190903）（上海虹橋中藥飲片有限公司）；紫草（上海蔡同德堂中藥飲片有限公司，批號：19090202），經上海市皮膚病醫院主任藥師朱全剛鑒定，龍葵藥材為茄科植物龍葵Solanum nigrum L.的全草；鳳尾草藥材為鳳尾蕨科植物鳳尾草Pteris multifida Poir.的全草；紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle)Johnst.的干燥根；白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.的干燥根；山藥為薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb的干燥根莖。

1.2 試劑 生理鹽水（山東齊都藥業有限公司，批號：20190 42203）；10%福爾馬林中性組織固定液（南昌雨露實驗器材有限公司，批號：190908）；無水乙醇（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20200319）；鹽酸（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20151105）；氨水（上海凌峰化學試劑有限公司，批號：20161123）；中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）；高效切片石蠟（上海華永石蠟有限公司）；蘇木素-伊紅染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器JS6-01型大稱量電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；ZNHW型電熱套（上海予申儀器有限公司）；OSB-2100型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；載玻片（武漢賽維爾生物科技有限公司）；蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）；JB-P5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；JB-L5型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技有限公司）。

1.4 實驗動物6～8周齡SPF級BALB/c小鼠20只，雌雄各半，體質量（20±2）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2018-0004。小鼠分籠飼養于動物房，5只/籠，自由攝食與飲水，環境溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%。本實驗經同濟大學機構倫理委員會批準，并按照機構指南進行。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 稱取各中藥材飲片并置10倍溫水中浸泡30 min，第一次煎煮2 h，第二次8倍水煎煮1 h。合并濾液，低溫靜置過夜。取上清液旋轉蒸發進行濃縮，將黏稠濃縮液放至-80℃預凍3～4 h，隨后利用真空冷凍干燥機進行干燥并打粉，形成龍葵銀消干浸膏粉。

2.2 劑量設計 參考藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則[7]，采用最大給藥量進行灌胃給藥。折算成每只小鼠一天給予量最多為0.375 g干浸膏粉，相當于375倍成人臨床劑量。

2.3 動物分組及給藥 按參考文獻中方法[8-9]，將20只小鼠按體質量隨機分為空白組和給藥組，雌雄各半，每組10只。取龍葵銀消干浸膏粉0.3 g，用0.4 mL純水溶解，得含干浸膏粉濃度為0.75 g/mL的龍葵銀消浸膏。給藥組每天給予龍葵銀消浸膏0.5 mL，空白組給予同體積的生理鹽水，連續給藥14 d。

2.4 觀察指標

2.4.1 體質量 每日記錄小鼠體質量，觀察各組體質量增長情況。

2.4.2 AST、ALT、BUN、CREA、UA血液生化學檢測 末次給藥后，利用摘眼球取血法采血，離心取血清，檢測血清肝腎功能生化指標，包括谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）。腎臟功能指標包括血尿素氮（BUN）、血肌酐（CREA）、尿酸（UA）。

2.4.3 臟器系數 末次給藥后對小鼠進行麻醉、解剖，取肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟組織進行稱量臟器質量，計算各臟器系數，臟器系數=臟器質量/體質量×100。

2.4.4 病理組織學檢查 將小鼠肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟組織用4%多聚甲醛固定24 h以上，進行石蠟包埋切片，片厚4 μm，進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察。

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計軟件進行分析，計量資料采用“均數±標準差”（s）表示，對各組進行正態性檢驗與方差齊性檢驗，采用單因素方差分析。重復測量數據采用重復測量方差分析，數據經Mauchly球對稱檢驗，若P＞0.05，則認為該數據滿足球對稱假設；反之則不滿足球對稱假設，則用Greenhouse-Geisser法對組內效應的F界值進行校正。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 兩組小鼠不同時間點體質量比較 給藥前后不同時間小鼠體質量比較，差異有統計學意義（F=7.656，P＜0.001），即存在時間效應，兩組均如此，說明空白組和給藥組小鼠的體質量均隨時間的推移而發生明顯變化。兩組小鼠體質量總體比較，差異有統計學意義（F=36.610，P＜0.001），即存在分組效應，說明不同組別對小鼠體質量變化具有顯著性影響。第0、4天給藥組小鼠的體質量低于空白組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；第8、12、14天給藥組小鼠體質量明顯低于空白組（P＜0.05）。時間和組別不存在交互效應（F=3.281，P=0.068＞0.05），說明不同組別的小鼠體質量雖然隨著時間的推移而發生變化，但差異無統計學意義。（見圖1、表1）

表1 兩組小鼠在不同時間點的體質量比較

表1 兩組小鼠在不同時間點的體質量比較

注：F分組主效應=36.610，P分組主效應＜0.001；F時間主效應=7.656，P時間主效應＜0.001；F交互效應=3.281，P交互效應=0.068；與空白組比較，aP＜0.05

組別 動物數（只） 0 d 4 d 8 d 12 d 14 d F P空白組 10 21.76±0.67 20.16±0.86 21.05±0.98 22.36±1.49 22.13±1.50 5.577 0.001給藥組 10 21.45±1.32 19.05±1.55 19.73±1.26a 20.55±1.53a 19.00±1.39a 5.505 0.019 t 0.662 1.980 2.621 2.670 4.872 P 0.517 0.063 0.017 0.016 0.000

圖1 交互效應輪廓圖

3.2 兩組小鼠血清肝腎功能生化指標比較 給藥組小鼠血清CREA水平低于空白組（P＜0.05），血清BUN、UA、AST、ALT水平與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 兩組小鼠血清肝腎功能生化指標比較

表2 兩組小鼠血清肝腎功能生化指標比較

注：與空白組比較，aP＜0.05

組別 ALT（U/L）AST（U/L）BUN（mg/dl）CREA（umol/L）UA（umol/L）空白組106.5±15.1 145.9±28.2 24.2±2.1 78.0±7.1 181.5±48.4給藥組126.0±34.0 177.3±33.6a 23.3±2.7 66.3±14.0a 170.4±28.6 t -0.630 -1.352 0.523 2.176 0.550 P 0.536 0.192 0.607 0.042 0.589

3.3 兩組小鼠臟器質量和臟器系數比較 給藥組小鼠脾臟質量及脾臟系數低于空白組（P＜0.05），心臟、肺臟、肝臟、腎臟質量及臟器系數與空白組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表3～4）

表3 兩組小鼠臟器質量比較

表3 兩組小鼠臟器質量比較

注：與空白組比較，aP＜0.05

組別 動物數（只） 心臟質量 肝臟質量 脾臟質量 肺臟質量 腎臟質量空白組 10 0.14±0.02 0.93±0.10 0.09±0.01 0.17±0.02 0.35±0.05給藥組 10 0.14±0.02 0.91±0.32 0.08±0.01a 0.17±0.02 0.33±0.04 t-0.953 -0.335 -2.905 0.238 -1.369 P 0.353 0.741 0.010 0.815 0.188

表4 兩組小鼠臟器系數比較

表4 兩組小鼠臟器系數比較

注：與空白組比較，aP＜0.05

組別 動物數（只）心臟系數 肝臟系數 脾臟系數 肺臟系數 腎臟系數空白組 10 0.65±0.07 4.22±0.34 0.41±0.04 0.77±0.09 1.58±0.19給藥組 10 0.68±0.09 4.58±1.54 0.39±0.06a 0.86±0.13 1.64±0.19 t 0.872 0.492 -8.579 2.082 0.596 P 0.395 0.629 0.000 0.052 0.558

3.4 病理學檢查結果 病理組織學檢查發現龍葵銀消浸膏連續給藥14 d后，給藥組心臟組織染色均勻，心肌纖維排列整齊，脾臟組織形態結構清晰，肺組織細支氣管形態結構未見明顯異常，與空白組比較，未顯示出明顯的心臟、脾臟、肺臟毒性。但是對肝臟、腎臟病理切片觀察發現，給藥組肝臟、腎臟局部出現病理組織學改變，主要表現為肝臟存在炎癥細胞浸潤，腎臟存在輕微腎間質輕微淤血等現象（箭頭所示）。（見圖2）

圖2 兩組小鼠各臟器組織病理切片圖（HE,×200）

4 討 論

毒性試驗是評價藥物安全性的重要環節。本研究采用BALB/c小鼠，連續14 d灌胃給予龍葵銀消浸膏，考察了小鼠對龍葵銀消浸膏的毒性反應。第0、4天給藥組小鼠的體質量低于空白組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；第8、12、14天給藥組小鼠體質量明顯低于空白組（P＜0.05）。對臟器系數考察中發現，給藥組小鼠脾臟質量、脾臟系數低于空白組（P＜0.05）。對各臟器進行組織病理學檢查發現肝臟、腎臟出現病理組織學改變，肝臟局部有炎癥反應，腎臟則表現為腎間質輕微淤血。為了進一步探究龍葵銀消浸膏對小鼠肝腎功能的影響，筆者對小鼠血清進行了肝腎功能生化學檢測。AST、ALT是臨床常見的肝功能檢查指標，結果顯示給藥組小鼠血清CREA水平低于空白組（P＜0.05），血清AST、ALT BUN、UA水平與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

肝臟、腎臟是藥物排泄的主要器官，發生毒性反應的概率要大于其他臟器。因此藥物毒性研究中比較重視肝腎的毒性研究[10]。目前國內外關于龍葵和紫草不良反應尤其是肝腎損傷的報道日益增多。澳洲茄堿和澳洲茄邊堿是龍葵的有效成分，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理作用[11-12]。有研究顯示，龍葵堿具有肝毒性，與影響肝臟中CYP450基因表達有關[13]。新紫草作為方中臣藥，具有清熱涼血、解毒透疹的功效。現代藥理學研究表明紫草具有抗炎、抗腫瘤作用，臨床常用來治療銀屑病[14]。但紫草含有的吡咯里西啶生物堿具有肝毒性，口服能引起大鼠尿中牛磺酸、氧化三甲胺及二甲基甘氨酸含量的持續增高[15-17]。另外，紫草有效成分紫草素、乙酰紫草素等萘醌色素類及提取物均顯示毒性[18-20]。由于君藥臣藥均含有肝腎毒性成分，可能是導致肝臟及腎臟病理變化的原因。因此本研究提示臨床使用過程中勿過量服用，長期服用時應注意藥物對肝臟、腎臟可能存在的潛在影響。由于本研究針對龍葵銀消浸膏對小鼠毒性只基于病理學及血液生化學研究，該藥物的肝腎損傷仍需進一步深入機理研究。