基于網絡藥理學和分子對接探究浙貝母治療急性髓系白血病的作用機制

白鹿原，安蘭花，王 懸，王晨琳，尹 一，王祥麒

（1.河南中醫藥大學針灸推拿學院，河南 鄭州 450008；2.河南中醫藥大學基礎醫學院，河南 鄭州 450008；3.河南中醫藥大學第一臨床醫學院，河南 鄭州 450008；4.河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450008）

急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）約占成人白血病的70%，病情發展迅速，自然病程僅數月。目前主要有支持治療、聯合化療、小分子靶向治療、新型細胞毒性藥物治療、免疫靶向治療、造血干細胞移植等治療方法[1-2]。通過上述治療手段，AML已取得一定治療效果，5年生存率達50%，但AML的高度異質性和復雜性導致治療后易復發，預后差，同時造血干細胞移植高昂的費用和配型的困難性也使該療法難以推廣[3-4]。因此研發新型療效好、價格低廉的治療AML藥物成為目前藥物研發的熱點，中藥具有價格低廉、副作用低、藥效作用明顯等多項優勢，成為當前藥物研發的新方向。

浙貝母為百合科植物浙貝母Fritillaria thunbergii Miq.的干燥鱗莖，又稱大貝、珠貝、元寶貝，為浙江道地藥材，是中藥處方中常用藥物。近年來，通過對浙貝母化學分析發現，浙貝母中主要含有生物堿、多糖和總皂苷等成分，藥用價值極高。藥理研究顯示，浙貝母具有鎮咳祛痰、鎮痛抗菌、抗潰瘍、抗炎止瀉、抗腫瘤等作用[5-6]。胡凱文等[7]通過90例白血病病例臨床對照試驗證實，浙貝母可明顯提高化療效果，尤其對難治、復發白血病療效顯著。浙貝母化學成分復雜，作用靶點眾多，現代研究對于浙貝母治療急性髓系白血病的作用機制仍不清楚。本研究運用網絡藥理學方法預測浙貝母治療AML的作用靶點，并進行富集分析，構建“化學成分-靶點-通路”網絡，通過GEO數據庫、分子對接技術初步驗證，探討作用機制，為下一步的動物體內外藥理試驗提供了方向，同時為今后的臨床推廣應用及新藥研發提供依據。

1 方 法

1.1 浙貝母化學成分的篩選 通過中醫藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）檢索浙貝母的化學成分，根據毒藥物動力學（ADME）以口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為標準，對浙貝母化學成分進行篩選，同時結合文獻報道，對浙貝母化學成分進行補充。

1.2 浙貝母化學成分靶點的預測和篩選 使用TCMSP檢索浙貝母中化學成分相關靶點基因，并通過Uniprot蛋白質數據庫將預測的靶點基因標準化。同時通過有機小分子數據庫PubChem檢索浙貝母化學成分的3D結構，將其3D結構導入Swiss Target Prediction數據庫，預測化學成分靶點信息，剔除可能性（Probability）為0的基因后匯總剔重，可得到Swiss Target Prediction數據庫預測基因。將2個數據庫預測的靶點基因進行合并，剔重，即得到浙貝母化學成分靶點基因。

1.3 急性髓系白血病靶點的獲取

1.3.1 疾病數據庫中急性髓系白血病靶點的篩選 以“acute myelogenous leukemia”為關鍵詞，通過OMIM數據庫、GeneCards數據庫，檢索AML的潛在靶點，再通過DRUGBANK數據庫尋找AML一線臨床藥物靶點進行補充。將3個數據庫得到的靶點基因通過Uniprot標準化后合并剔重，即得到AML靶點基因。

1.3.2 GEO數據庫急性髓系白血病差異基因的篩選 以“acute myelogenous leukemia”為關鍵詞，檢索GENE EXPRESSION OMNIBUS數據庫，查找正常人群與AML患者的骨髓高通量測序數據集。通過R軟件進行分析篩選并進行可視化處理。

1.4 浙貝母化學成分-急性髓系白血病靶點PPI網絡的構建 為進一步探究浙貝母化學成分同AML的作用關系，通過Venny2.1.0取兩者交集基因并繪制韋恩圖，交集基因即為浙貝母作用AML的靶點基因。將其提交至STRING數據庫，設定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設定為“medium confidence(0.4)”，余默認設置不變，構建蛋白質相互作用網絡（PPI）。將PPI數據導入至CytoScape3.7.2軟件，使用“Network analyzer”功能，對PPI網絡進行拓撲分析，篩選浙貝母作用AML的核心靶點基因。

1.5 基因功能與通路富集分析 將浙貝母作用AML的靶點基因導入至DAVID Bioinformatics Resources 6.8，設定物種為“Homo sapiens”，提交后即得到靶點基因的GO注釋分析和KEGG通路分析結果。后運用統計學的方法，設置P≤0.05，對富集分析結果進行篩選。將篩選的結果導入R軟件，通過“ggplot2”包對排名靠前的數據進行可視化處理。

1.6 浙貝母化學成分-靶點-通路網絡圖的構建 運用CytoScape3.7.2軟件構建化學成分-靶點-通路網絡圖，并對網絡圖進行拓撲分析，計算浙貝母主要化學成分網絡節點特征參數。

1.7 GEO差異基因驗證 檢索GEO數據庫，確定相應數據集，篩選出AML的差異基因，此為經過臨床驗證的AML差異基因，為探求浙貝母與AML之間作用關系，分析浙貝母靶點基因與AML差異基因是否存在交集基因。

1.8 分子對接驗證 為驗證浙貝母化合物對AML相關基因的作用效果，采取分子對接的方法初步驗證。選取“1.4”項中所得的核心靶點基因，取度值排名靠前的基因，結合“1.7”項中所取得的交集基因，取兩者并集。后通過PDB（http://www.rcsb.org/）數據庫，結合蛋白種屬、分辨率、是否含有共晶配體、活性口袋是否完整等限定條件，對同種基因蛋白的不同晶體結構進行篩選，下載匹配度較高的蛋白晶體結構文件，通過MOE軟件中dock功能與浙貝母化學成分進行分子對接，根據其對接評分S評估浙貝母化學成分同作用靶點的結合穩定性，從而評價浙貝母對AML的作用效果。

2 結 果

2.1 浙貝母化學成分的篩選 通過TCMSP檢索出浙貝母化學成分17種，經ADME篩選后獲得浙貝母化學成分7種。再通過對相關文獻的挖掘[8]，補充一些OB、DL值較低，但經藥理學研究，對人體仍有藥理活性的成分，如浙貝母甲素、浙貝母乙素。最終篩選出浙貝母化學成分9種。（見表1）

表1 浙貝母主要化學成分基本信息

2.2 浙貝母化學成分靶點的篩選 通過TCMSP化合物靶點預測功能，檢索出靶點72個，剔重后獲得51個潛在靶點。通過Swiss Target Prediction平臺靶點預測功能，預測出相關化學成分靶點信息后，剔除可能性（Probability）為0的基因后匯總剔重，獲得370個潛在靶點基因。將2個數據庫預測的靶點基因進行合并后再次剔重，即得到浙貝母化學成分靶點基因397個。

2.3 急性髓系白血病靶點基因的獲取

2.3.1 疾病數據庫中急性髓系白血病靶點的篩選 通過GeneCards數據庫檢索與AML相關靶點基因2 405個，為獲得與AML密切程度較高基因，根據經驗篩取Relevance score≥10的靶點基因為AML潛在靶點，篩選后獲得785個靶點基因。再檢索OMIM數據庫、DRUGBANK數據庫，依次將3個數據庫得到的靶點基因通過Uniprot標準化，最后將3個數據庫靶點基因匯總剔重，即得到AML相關靶點基因892個。

2.3.2 GEO中急性髓系白血病差異基因的篩選 通過對GEO數據庫的檢索，確定GSE84881數據集[9]，該芯片數據集收集了4個正常骨髓間充質干細胞樣本和19個AML患者骨髓間充質干細胞樣本的基因表達譜。后使用R軟件下載并分析GSE84881原始數據，以P≤0.05且log2FC絕對值≥1為條件進行差異分析后獲得206個差異表達基因，此為急性髓系白血病差異基因。選取log2FC絕對值≥2的基因通過TBtools[10]軟件繪制聚類熱圖，同時將原始數據繪制火山圖。（見圖1）

圖1 AML相關芯片差異基因聚類熱圖和火山圖

2.4 浙貝母化學成分-急性髓系白血病PPI網絡的構建 將浙貝母化學成分相關靶點基因與AML靶點基因通過Venny2.1.0取交集并繪制韋恩圖。（見圖2）將所得的97個交集基因提交至STRING數據庫，分析PPI網絡。后將PPI數據導入至CytoScape3.7.2軟件，通過拓撲分析，進而繪制出PPI網絡圖。（見圖3）依據相關拓撲參數對浙貝母作用于AML的基因進行篩選，取連接度值（degree）≥2倍中位數的基因為核心靶點基因，共15個。（見表2）

表2 浙貝母作用于AML的核心靶點基因及其節點網絡參數

圖2 浙貝母-急性髓系白血病靶點基因韋恩圖

圖3 浙貝母作用于AML靶點基因的PPI網絡

2.5 基因功能與通路富集分析 通過DAVID數據庫對浙貝母作用于AML的靶點基因進行富集分析，分析結果包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）、KEGG等4個部分，設置P≤0.05對分析結果進行篩選，分別得到348、84、49條生物功能信息，96條信號通路信息，并通過R軟件中“ggplot2”包對排名較前的結果進行可視化處理。（見圖4）生物過程中主要涉及細胞的增殖、細胞的凋亡、細胞遷移、血小板活化、MAP激酶活性的正調控；分子功能中主要涉及酶、大分子蛋白質的結合，部分酶活性的調節；細胞組分主要包括細胞核、細胞質、核質、細胞表面、線粒體、蛋白質復合物、核染色質等，浙貝母對AML的作用可能與以上這些功能過程相關。在KEGG信號通路方面，通過對排序較前的30條信號通路研究發現，主要為細胞凋亡、細胞增殖、代謝、免疫調節、促血管生長等通路。（見圖4）

圖4 浙貝母作用于AML靶點基因的富集分析

2.6 浙貝母化學成分-靶點-通路網絡圖的構建 通過CytoScape3.7.2軟件構建浙貝母化學成分-靶點-通路網絡圖，并分析浙貝母主要化學成分的網絡節點特征參數。此網絡圖包括9個浙貝母化合物節點，97個作用靶點節點，15個通路節點及478條相互關系連線。每個化合物平均與21個靶點相互作用，每個信號通路平均有19.8個相關靶點參與調控，這說明了浙貝母可通過多成分、多靶點協同作用于多個通路來發揮其對AML的治療作用。（見圖5、表3）

圖5 浙貝母化學成分-靶點-通路網絡圖

表3 浙貝母主要化學成分網絡節點特征參數

2.7 GEO差異基因驗證GEO數據庫是儲存芯片、二代測序及其他高通量測序數據的數據庫，我們可通過該數據庫檢索到任何物種的基因表達數據。GEO上有4類數據GSM、GSE、GDS、GPL。GSE數據為一個試驗項目的多個芯片試驗，通過“2.3.2”項中確定GSE84881數據集，該數據集包括4個正常樣本，19個AML樣本，運用R軟件篩選獲得206個AML差異基因。將AML差異基因與浙貝母化學成分靶點基因提交至Venny2.1.0取得交集基因，交集基因為CTSC、CYP1B1、DAPK1、LGALS3、PTGS2。該結果不但驗證了浙貝母對AML確有調節作用，也側面說明這5個基因也為浙貝母作用于AML的靶點基因。

2.8 分子對接驗證 分子對接是一種較為成熟的計算機輔助藥物設計方法，其原理基于鎖鑰模型，通過計算機模擬計算配體與受體在空間結構、靜電作用、范德華力作用、氫鍵等各方面是否互補匹配，進而評估配體與受體能否結合及結合效果[11]。選取5個“2.7”項中獲得的AML差異基因和度值排名靠前的6個浙貝母作用于AML核心靶點基因，于PDB數據庫下載蛋白晶體結構PDB文件，后使用MOE軟件與浙貝母中的9個主要化學成分分別進行對接，對接結果見圖6。根據MOE軟件打分函數London dG計算，對接評分S值越低，配體與受體結合越穩定，對接效果越好。分子對接結果顯示所有化合物平均對接評分為-5.83，所有對接結果中，6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1，4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖與CYP1B1結合效果最好，評分為-10.1，分子對接3D模式及2D模式見圖7。CYP1B1為浙貝母結合效果最好的靶點蛋白，平均對接評分為-8.5。

圖6 分子對接結果

圖7 分子對接模式圖

3 討 論

急性髓系白血病（AML）是造血祖細胞變異引起的惡性克隆性疾病，中醫典籍對此病沒有明確記載，《圣濟總錄》熱勞篇有云：“論曰熱勞之證，心神煩躁，面赤頭疼，眼澀唇焦，身體壯熱，煩渴不止，口舌生瘡，食飲無味，肢節酸疼，多臥少起，或時盜汗，日漸羸瘦者是也。”這段癥狀描述與AML發熱、感染、出血、乏力、久病后身體消瘦等癥狀十分相似。根據AML臨床癥狀及發病特點，可歸為“虛勞”“血證”“瘀積”“痰核”等范疇。

在長期臨床實踐中發現，AML進展過程中多見痰核、瘰疬、瘀斑、瘀點、發熱等臨床表現，多與痰、瘀、熱等病理因素密切相關。清代高錦庭曾言：“癌病者，非陰陽之氣郁結腫，乃五臟瘀血，濁氣痰凝而成。”正氣虧虛，以致氣血虛弱，津聚液停匯聚為痰，痰阻則氣滯，氣機阻滯以致血行不利，日久形成血瘀，痰與瘀相互交織形成痰瘀互結，此為AML發病關鍵病機，在此疾病發展過程中，痰邪為致病關鍵因素[12-13]。基于對AML致病因素的判斷，其治法當選化痰散結，浙貝母為苦寒之藥，功擅化痰止咳，清熱散結，又可治瘰疬癭瘤、瘡癰腫毒之病，當為首選之藥。在臨床實踐中，宋娜莎等[14]通過200例難治性急性白血病患者隨機對照試驗證實復方浙貝母顆粒能夠誘導腫瘤細胞死亡，降低機體耐藥力，增強機體對化療藥物的吸收，增強化療效果。李冬云等[15]通過多中心隨機臨床對照試驗證實浙貝母顆粒輔助化療能夠提高難治性急性白血病圍化療期臨床療效，以上多個臨床試驗證實浙貝母治療AML具有顯著療效。

本課題組通過網絡藥理學的方法篩選出浙貝母中主要化學成分，并進行對接驗證，在度值排名靠前的幾個化合物中，6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖、紫鄂貝堿、β-谷甾醇、浙貝母甲素、浙貝母乙素對接效果較好。相關基礎研究結果顯示浙貝母甲素、浙貝母乙素為浙貝母中主要的生物堿，具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥（MDR）的作用，而且能逆轉兩種不同機制的腫瘤細胞MDR耐藥性[16-17]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，是動植物細胞膜的主要組成成分，具有抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節等多種藥理活性[18]。紫鄂貝堿與6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷均為浙貝母中化學成分，與較多AML靶點基因有作用關系，分子對接驗證顯示與對接靶點蛋白均有較好的結合穩定性，因此推測這兩個化合物對AML有較好的治療效果，但目前暫未發現相關研究，本課題組接下來將進一步研究其治療AML的作用機制。

分子對接結果顯示，浙貝母主要化學成分與CYP1B1、GAPDH、PTGS2、CCND1靶點基因有較好的結合效果，這些靶點基因主要涉及細胞凋亡、細胞周期、細胞增殖、代謝、免疫調節等方面，為浙貝母作用的核心靶點。CYP1B1屬于細胞色素酶基因家族，表達的酶與人體內藥物代謝、激素代謝的調控相關。GAPDH為糖代謝過程中的關鍵酶，對ATP生成起關鍵作用，有關研究發現，GAPDH在能量代謝、細胞凋亡與腫瘤發生、DNA修復等方面發揮重要作用[19]。PTGS2（COX-2）可以促進細胞數目增加，減緩細胞凋亡速度，加速新生血管的生成。CCND1基因編碼的cyclin D1是細胞周期蛋白家族中一員，可促進細胞的增殖。同時CCND1也是PI3K/AKT信號通路的重要基因，該信號通路激活后，促進細胞增殖，從而使AML細胞對藥物的敏感性下降，影響治療效果[20-21]。

DAVID數據庫對浙貝母作用于AML的靶點基因富集分析結果顯示，涉及的通路多集中在細胞凋亡、細胞增殖、代謝、免疫調節、促血管生長等方面。在細胞增殖、凋亡方面，PI3K/AKT在白血病細胞發揮著重要作用，活化可促進白血病細胞增殖并抑制其凋亡，其作用通過調節各種生理狀態下的線粒體來實現。線粒體受外界刺激引發膜通透性改變，激活Caspase-9、Caspase-3引起細胞凋亡[22-24]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號通路是人血管發生和血管生成過程的關鍵通路，其生成物VEGF可作用于內皮細胞的糖基化細胞的有絲分裂素，從而促進腫瘤細胞的血管生成[25]。白血病細胞的生長必須依賴新生血管生成來提供足夠的營養物質，從而使自身不斷增殖擴張，因此血管新生對于AML意義重大。在AML患者病變組織內均存在VEGF過度表達情況，VEGF不斷促進內皮細胞分裂增殖，產生大量新生血管，對AML細胞生長轉移發揮協同作用。同時研究發現AML細胞自分泌的VEGF因子對正常骨髓造血細胞的生長增殖會起到抑制作用，對自身生長增殖起促進作用[26-28]。

分子對接驗證結果顯示，浙貝母中主要化合物6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖與CYP1B1結合穩定性最高。CYP1B1屬于細胞色素P450超家族中CYP1家族，參與大量外源性化學物質和某些內源性物質的代謝，LOPES B A[29]研究結果顯示CYP1B1基因中rs1056836位點的GG基因型與降低AML的風險密切相關。CYP1B1酶為在腫瘤組織中高表達的藥物代謝酶，可以在3個不同的水平發揮作用：誘變性4-羥基雌二醇的形成；前致癌物的生物活化；腫瘤耐藥性。由于其特殊的生理功能，細胞色素CYP1B1是一種很有前途的生物標志物和治療靶點[30-31]。6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖通過對CYP1B1靶點調節發揮治療AML的作用，考慮其可作為新型CYP1B1酶抑制劑，本課題組將進一步研究其作用效果。

綜合分析，本研究運用網絡藥理學和分子對接的方法，聯合GEO數據庫，對浙貝母作用于AML的主要化學成分、核心靶點、主要作用通路進行了分析，揭示了浙貝母治療AML的作用機制，后續本課題組擬根據分子對接結果設計動物體內外藥理試驗，對6-甲氧基-2-乙酰基-3-甲基-1,4-萘醌-8-O-β-D-吡喃葡萄糖通過對CYP1B1靶點的調節治療AML的機制進行深入研究，為臨床應用及新藥研發提供更多參考。