基于“腎絡癥瘕”理論探討腎炎防衰液治療腎間質纖維化的藥效物質基礎與機制*

劉夢超，王明哲，肖 遙，沈 存，王夢迪，趙文景

（1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；2.北京中醫藥大學，北京 100010）

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是大多數慢性腎臟疾病的共同途徑，以成纖維細胞增生、細胞外基質在腎間質過度沉積為主要病理特征，在腎臟結構和功能的逐步喪失中起重要作用。無論是腎小球疾病、腎小管間質病變還是腎血管疾病，其腎功能損害的程度都與RIF密切相關[1-2]。腎間質纖維化程度也被認為是預后指標和治療指導之一，然而目前在RIF的防治方面尚缺乏有效的措施。

中醫藥治療RIF具有一定優勢。“腎絡癥瘕”理論[3-4]是王耀獻以絡病學說、癥瘕理論、腎臟病理研究為基礎，由呂仁和糖尿病腎病“腎絡微型癥瘕”理論發展推進而成，已形成理、法、方、藥較完備的中醫藥治療慢性腎臟疾病的理論體系。該理論認為慢性腎臟疾病的主要病機是腎疾日久，失治誤治，“腎絡徵瘕”形成，終致腎用失司，濕濁瘀毒潴留。聚散消長是“腎絡癥瘕”理論的核心病機，持續的聚散失衡，腎絡痰濕、瘀血、瘀毒漸聚膠結，即成“腎絡癥瘕”，與RIF的病理發展過程相符合。

王耀獻教授提倡應用消癥散結法，常用腎炎防衰液治療RIF[5]。腎炎防衰液由黃芪、當歸、海藻、熟地黃、大黃組成，有補氣扶正、消癥散結之功，經多年臨床證實其療效確切。前期臨床試驗提示腎炎防衰液可延緩CKD5期非透析患者的首次進入透析時間，減少CKD5期患者透析事件發生率[6]；多項針對單側輸尿管結扎（unilateral ureteral obstruction,UUO）誘導的RIF大鼠模型的實驗研究顯示，腎炎防衰液對RIF具有抑制炎癥、減少細胞外基質（extracellular matrix,ECM）積聚等作用[7-8]，但其具體機制尚未完全探明。因此，本研究通過可體現中醫藥多成分、多靶點、多途徑的網絡藥理學方法，探尋腎炎防衰液治療RIF的具體機制，以期為進一步的研究提供思路和依據。

1 材料與方法

1.1 腎炎防衰液有效成分及作用靶點的篩選 以“黃芪”“當歸”“海藻”“熟地黃”“大黃”為檢索詞，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索腎炎防衰液的化學成分，根據口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18進行篩選，獲取腎炎防衰液的活性成分，并在該數據庫查詢這些成分的對應靶點。另以“HUANG QI”“DANG GUI”“HAI ZAO”“DI HUANG”“SHU DI HUANG”“DA HUANG”為關鍵詞，于BATMAN-TCM數據庫（http://bionet.Ncpsb.org/batman-tcm/)以“P＜0.05且Score cutoff≥39”為標準篩選腎炎防衰液的有效成分及作用靶點。利用UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）對靶點信息進行規范化處理。將上述篩選后的成分與靶點合并后去除重復項，建立“中藥-成分-靶點”數據庫。

1.2 RIF作用靶點的獲取 以“renal interstitial fibrosis”為關鍵詞，應用GeneCards數據庫（https://genecards.weizmann.ac.il/v3/）、DisGeNET平臺（https://www.disgenet.org/home/）獲取RIF相關靶點，利用UniProt數據庫進行規范化處理，合并后去掉重復項，獲得RIF作用靶點。

1.3 網絡構建

1.3.1 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡的構建 將“1.1”項中獲取的成分靶點與“1.2”項中的RIF作用靶點通過韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，獲得共有靶點，即腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點。將其導入String數據庫，限定物種為“Homo Sapiens”，構建PPI網絡，然后將該文件導入到Cytoscape3.7.2軟件進行分析，獲得核心靶點。

1.3.2 “成分-靶點”網絡的構建 將共有靶點與其對應中藥成分通過Cytoscape3.7.2軟件構建“成分-靶點”網絡，利用“Network analyze”功能進行分析，并通過該軟件的Centiscape插件根據自由度篩選出網絡中的核心成分。

1.3.3 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡的構建 基于“1.3.2”項的“成分-靶點”網絡，與RIF、疾病靶點、中藥關聯，應用Cytoscape3.7.2軟件繪制“中藥-成分-靶點-疾病”網絡并進行分析。

1.4 京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 通過Cytoscape3.7.2的Clue GO 2.5.4插件對共有靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，獲取腎炎防衰液治療RIF的主要通路。

1.5 分子對接預測 通過Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載核心成分的mol2格式，通過Chem3D對所下載的化合物進行能量最小化，并轉化為pdb格式；通過PDB數據庫（https://www.rcsb.org）下載自由度前5位核心靶點的晶體結構PDB格式文件。采用AutoDock Tools-1.5.6軟件對上述文件進行常規處理，將處理后的化合物作為小分子配體，5種蛋白靶點作為受體，根據小分子與靶點的作用位點確定的Grid Box的中心位置以及長寬高，最后通過AutoDock vina和python腳本進行批量對接，對分子對接結果進行分析，化合物與蛋白的結合作用可視化采用Pymol軟件。

2 結 果

2.1 藥物成分篩選與潛在作用靶點的獲取 通過TCMSP數據庫與BATMAN-TCM數據庫進行篩選，獲得黃芪的活性成分38個，當歸的活性成分124個，海藻的活性成分5個，熟地黃的活性成分5個，大黃的活性成分28個，總計200個。黃芪的潛在作用靶點253個，當歸的潛在作用靶點468個，海藻的潛在作用靶點100個，熟地黃的潛在作用靶點94個，大黃的潛在作用靶點249個，總計1 164個。5種中藥潛在作用靶點再次合并去重，獲得腎炎防衰液潛在作用靶點共701個。將5種中藥的潛在作用靶點繪制韋恩圖，可見多種中藥具有共同靶點。（見圖1）

圖1 中藥潛在作用靶點分布

2.2 RIF靶點及共有靶點的獲取 應用GeneCards數據庫獲取RIF靶點328個，通過DisGeNET平臺獲得138個，兩者合并去重后獲得RIF潛在靶點共429個，與腎炎防衰液的潛在作用靶點通過韋恩圖取交集，獲得76個共有靶點（見圖2），這些靶點可能是腎炎防衰液治療腎間質纖維化的潛在作用靶點。將這些靶點導入String數據庫，限定物種為“Homo sapiens”，導出數據后應用Cytoscape3.7.2軟件構建PPI網絡，該網絡共涉及76個節點和967條邊，節點表示成分與靶點，邊表示兩者之間相互作用，自由度是重要的網絡拓撲參數，表示與該節點直接相互作用的節點的數目，自由度越大，其關聯的生物功能越多，在網絡中的重要性就越大。結果顯示，共有37個靶點自由度值高于平均值（25.78），表明與其他蛋白相互作用較強，可能具有重要作用。（見表1）

表1 自由度大于平均值的重要靶點

圖2 RIF與腎炎防衰液的潛在作用靶點分布

2.3 成分-靶點網絡的構建與分析 將“2.2”項中獲取的76個共有靶點與其對應的117個中藥成分通過Cytoscape3.7.2軟件構建“成分-靶點”網絡，篩選腎炎防衰液治療RIF相關的活性成分。經網絡拓撲學分析，“成分-靶點”網絡共涉及194個節點，488條邊，節點的最大自由度為75，大于平均自由度（5.03）的活性成分有24個。（見表2）。

表2 可能參與腎炎防衰液治療RIF的活性成分

2.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡的構建 將中藥、包含共有靶點的成分、共有靶點與RIF通過Cytoscape3.7.2軟件構建網絡，紅色六邊形節點代表疾病，綠色菱形節點代表中藥，藍色矩形節點代表腎炎防衰液主要活性成分，黃色三角形節點代表潛在作用靶點。該網絡共有200個節點，682條邊，聚類系數0.357，網絡密度0.032，最短路徑為39 006（100%），網絡異質性1.325，平均自由度為6.333。（見圖3）

圖3 腎炎防衰液治療RIF“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖

2.5 KEGG富集分析 將腎炎防衰液治療RIF的共有靶點進行KEGG通路富集分析，篩選校正P≤0.01的項目，共富集到99條信號通路，根據P值由小到大排列，發現腎炎防衰液可能通過以下途徑參與RIF的治療，如糖尿病并發癥的晚期糖基化終末產物（AGE）-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、松弛素信號通路、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、白介素-17（IL-17）信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、脂肪細胞脂肪分解的調節、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路、Toll樣受體（TLRs）信號通路等。（見表3）

表3 腎炎防衰液治療RIF的潛在信號通路

2.6 分子對接 將24個核心成分作為小分子配體，選取自由度前5位的INS（PDB ID：6S4J）、IL-6（PDB ID：2HMH）、ALB（PDB ID：6RQ7）、VEGFA（PDB ID：4KZN）、TNF（PDB ID：2AZ5）作為蛋白受體進行分子對接，并獲取其結合能。若結合能＜0，表明兩者可自發結合，結合能≤-5.0 kJ/mol為分子與靶點結合性較好[9]，結合能越小表明結合活性越好。結果顯示，表中77.5%的活性成分可與靶點蛋白較好地結合。（見表4）將上述各基因與其結合排名前2位的化合物的分子對接模式可視化，可見上述化合物可很好地匹配INS、IL-6、ALB、VEGFA、TNF的活性口袋。（見圖4）

表4 腎炎防衰液核心成分與5種蛋白靶點的結合能（kJ/mol）

圖4 活性成分與靶點蛋白的結合模式

3 討 論

RIF的主要病理表現為間質成纖維細胞的增殖，ECM的過度沉積，細胞凋亡，腎小管損傷與大量炎癥細胞浸潤，其具體機制復雜，涉及多種炎癥細胞和細胞因子信號傳導之間復雜的相互作用，單一途徑的藥物很難奏效。因此，中醫藥的多成分、多靶點、多途徑的特點具有一定優勢。

腎炎防衰液是基于“腎絡癥瘕”理論而成，氣滯血行不暢、絡脈失養、氣血瘀滯、津凝痰結、絡毒蘊結與現代醫學中的血流動力學異常、細胞的保護及損傷、細胞因子的調節至ECM等有形之質的形成過程有一定相似之處[3-4]。在中醫方面消癥散結，改善氣血、痰濁、絡毒等淤積，在現代醫學方面改善大量炎癥細胞浸潤、抑制ECM的過度沉積等是本方的初衷。目前，前期臨床及動物實驗已證實其對RIF具有治療作用，但具體機制尚未完全清楚，因此，本研究基于網絡藥理學探索其藥效學基礎及潛在作用機制以指導進一步的研究。

經數據庫篩選，本研究共發現76個腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點，包括INS、IL-6、ALB、VEGFA、TNF、MAPK1、IL-1β、EGF、EGFR、TP53、MAPK8、NOS3、MMP9、CCL2、PTGS2、MAPK14、MMP2等。包含這些靶點的活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、7-O-甲基異丙醇胺、豆甾醇、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、蘆薈大黃素、芒柄花黃素、異鼠李亭、苯丁烯酮等。藥理學研究表明，槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、異鼠李素、蘆薈大黃素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮均具有一定的抗炎、抗腫瘤作用。轉化生長因子β（TGF-β）是迄今研究最多、最重要的致纖維化細胞因子，槲皮素可通過抑制TGF-β來延緩腎纖維化[10]。異鼠李素是源自槲皮素的代謝物，可調節NF-κB、PI3K/Akt、MAPK及其下游因子，阻斷TLR4途徑，減少ROS的產生以減輕炎癥反應，還可抑制ROS介導的HIF-1α積累來發揮腎臟保護作用[11-12]。山萘酚可通過激活BMP-7-Smad1/5信號通路改善腎纖維化[13]。大黃酸是大黃中最具生物活性的成分，可通過調節AMPK/mTOR途徑來抑制UUO大鼠腎小管細胞的自噬，抑制UUO誘導的p-STAT3、膠原蛋白I和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）[14-15]。此外，β-谷甾醇、豆甾醇還具有明顯的降脂作用[16-17]，芒柄花黃素有抗氧化、降低高血糖、胰島素抵抗等作用[18]。這些成分是腎炎防衰液發揮治療作用的物質基礎，提示腎炎防衰液可能通過抗炎、調節自噬、糖脂代謝等發揮治療作用。

本研究進一步將76個腎炎防衰液治療RIF的潛在作用靶點進行KEGG富集，發現腎炎防衰液可能通過抑制炎癥反應，調節糖脂代謝、自噬、ECM的沉積等多個方面延緩RIF進程，與上文中活性成分的作用相符。

炎癥反應在RIF的發生、發展中起著至關重要的作用。多種趨化因子、白細胞介素家族、黏附分子等可以刺激一系列炎癥信號傳導途徑，導致ECM過度沉積，腎間質纖維化，最終導致腎功能不全。經KEGG富集的通路中，TNF信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、酪氨酸激酶/信號轉導子和轉錄激活子（JAK/STAT）信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、NF-κB信號通路等均與炎性損傷密切相關。JAK/STAT信號通路是誘導巨噬細胞活化的重要通路。活化后的腎間質巨噬細胞可釋放大量的炎癥因子，進而促進成纖維細胞的激活，誘導腎小管上皮細胞的分化與凋亡。此外，巨噬細胞的浸潤還可增加膠原的沉積，進一步加速RIF的進程。在本研究發現的潛在作用靶點中，多種細胞因子與JAK/STAT通路的激活相關，如IL-2與STAT1、STAT3、STAT5A和STAT5B的激活密切相關，IL-6可激活STAT1和STAT3，EGF可激活STAT3，IL-13可激活STAT6等。STAT1可與Runx調節蛋白的結合，作用于Smad3，STAT3與NF-κB的p50和p65亞基可直接結合，STAT1也與NF-κB存在協同作用[19-20]。可見JAK/STAT通路與本研究富集出的多個通路存在相互作用。TNF-α是TNF信號通路、MAPK信號通路和T細胞受體信號通路的關鍵因子，其作為最重要的炎癥因子之一參與了RIF進程。激活的單核-巨噬細胞、損傷的腎小管上皮細胞、內皮細胞等均可產生該因子，其具有加速ECM堆積、損傷腎單位、促進系膜細胞增殖、加速脂質代謝等的作用，可進一步加重RIF。同時，TNF-α與NF-κB也存在協同作用，其升高可促進NF-κB水平的升高和NF-κB信號通路的激活，從而進一步增加炎癥因子的表達，導致炎癥損傷的加重。此外，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）與絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）均參與介導腎纖維化中的促炎和促纖維化途徑[21]。松弛素可在UUO的早期階段下調TLR4-NF-κB信號通路，使巨噬細胞極化向M2表型轉移，并改善RIF[22]。

自噬在RIF初期具有保護腎臟的作用，但自噬的持續激活可促進纖維化的產生[23]。PI3K/Akt信號通路具有調控自噬的作用，與RIF炎性損傷的發生有關，其主要被TGF-β1激活，且參與其誘導的腎小管上皮間質轉分化過程[24]，還可通過mTOR信號通路的激活抑制細胞自噬[25]。

此外，MMPs/組織金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）的失衡直接影響ECM的沉積，在RIF的機制中具有重要的位置。本研究發現的潛在作用靶點中，MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、PLG，COL1A1是MMPs活化和膠原降解中的重要因子，可調控ECM的沉積，與腎炎防衰液擬通過消癥散結法改善腎纖維化的初衷相通。

綜上所述，本研究篩選出腎炎防衰液多種可改善RIF的活性成分，發現其可能參與治療RIF的多種途徑，其中與炎癥反應相關最多。全方可能通過抑制炎癥反應、調控自噬、調節糖脂代謝等延緩RIF的發展。提示腎炎防衰液在抑制炎癥反應方面的研究前景廣闊，對自噬反應的調控也尚待進一步的研究。