淋球菌耐藥監(jiān)測結(jié)果分析

梁艷華 曹文苓 黎小東 梁景耀 李華平 楊日東 畢超廣州市皮膚病防治所檢驗(yàn)科 50095；廣州市皮膚病防治所性病科 50095

淋病是常見的性傳播疾病，其發(fā)病率居高不下，2017—2019年居我國乙類傳染病的發(fā)病率第4位［1-2］。淋球菌是引起淋病的病原體，目前，淋球菌對多種抗生素產(chǎn)生不同程度耐藥，耐藥性日趨嚴(yán)重［3］，而且因時(shí)間和地區(qū)的變化而有所不同，因此世界各地建立了淋球菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，旨在掌握其耐藥機(jī)制，研究對策。

我們根據(jù)國家疾病預(yù)防控制中心（CDC）性病控制中心的淋球菌耐藥監(jiān)測方案，監(jiān)測淋球菌對7種抗生素的耐藥情況，包括產(chǎn)青霉素酶淋球菌（penicillinase producing Neisseria gonorrhoeae，PPNG）相質(zhì)粒介導(dǎo)的高度耐四環(huán)素淋球 菌（highly tetracycline resistant Neisseria gonorrhoeae，TRNG）的流行情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 淋球菌 100株淋球菌全部來自2019年12月至2020年11月廣州市皮膚病防治所性病門診患者的泌尿生殖道分泌物；患者全部為男性，年齡17～61歲。所有淋球菌經(jīng)過革蘭染色、氧化酶試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)確認(rèn)鑒定［4］，傳代一次后洗于脫脂牛奶中，于-80℃低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 抗生素 青霉素（R082HO，USP）、四環(huán)素（R039WO，USP）、環(huán) 丙 沙 星（10L049，USP）、大 觀霉素（HOM399，USP）、頭孢曲松（R07420，USP）、頭孢克肟（R095XO，USP）、阿奇霉素（R043PO，USP）均由中國CDC性病控制中心提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 淋球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（英國OXOID公司生產(chǎn)，LOT1784808）加入10%脫纖維新鮮羊血。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株 世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）標(biāo)準(zhǔn)淋球菌菌株D、G、J、L、P由中國CDC性病控制中心提供。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將淋球菌菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株用T-M平板培養(yǎng)16～20 h，取菌苔［5］，用生理鹽水制成1×107CFU/ml菌懸液。

1.2.2 最 低 抑 菌 濃 度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定 采用WHO西太區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦的瓊脂稀釋法［4］，先將7種抗菌藥物按要求配成原液，再倍比稀釋成不同的濃度，青霉素0.008～32.000 mg/L，環(huán)丙沙星0.008～32.000 mg/L，四環(huán)素0.25～16.00 mg/L，大觀霉素1～128 mg/L，頭孢曲松和頭孢克肟0.002～1.000 mg/L，阿奇霉素0.016～8.000 mg/L。將3.70%淋球菌基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌，水浴冷卻至50℃，加入脫纖維新鮮羊血（終濃度10%）。取0.2 ml倍比稀釋好的7種抗菌藥物工作液，加入20 ml淋球菌血液基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻后傾倒平板。從低濃度至高濃度配制各種濃度的平板。用多頭接種器將實(shí)驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液接種于各神濃度的平板，置36℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，記錄無菌落生長的濃度MIC。以WHO的D、G、J、L、P標(biāo)準(zhǔn)菌株作質(zhì)控。藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)采用WHO西太區(qū)淋球菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦的標(biāo)準(zhǔn)［6-7］：青霉素MIC≤0.06 mg/L為敏感，MIC 0.12～0.10 mg/L為低敏，MIC≥1 mg/L為耐藥；環(huán)丙沙星MIC≤0.06 mg/L為敏感，MIC 0.12～0.50 mg/L為低敏，MIC≥1 mg/L為耐藥；四環(huán)素MIC≥1 mg/L為耐藥，MIC≥16 mg/L為TRNG；頭孢曲松和頭孢克肟MIC＜0.25 mg/L為敏感，MIC≥0.25 mg/L為低敏；大觀霉素MIC≤32 mg/L為敏感，MIC＝64 mg/L為低敏，MIC≥128 mg/L為耐藥；阿奇霉素MIC≤0.25 mg/L為敏感，MIC＝0.5 mg/L為低敏，MIC≥1 mg/L為耐藥。

1.2.3 β-內(nèi)酰胺酶測定 采用紙片碘量法測定菌株是否產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶，具體操作如下：在試中加入100μl青霉素溶液（10 000 U/ml）、100μl淀粉溶液（1%）、50μl碘試劑，呈藍(lán)色混合物在一濾紙條上滴50μl試劑，將一接種環(huán)培養(yǎng)物涂在藍(lán)點(diǎn)上，放置1～2 min，如藍(lán)色變成無色即為β-內(nèi)酰胺酶陽性，顏色無變化則為陰性。每次試驗(yàn)以WHOJ株作陽性對照，D株作陰性對照。β-內(nèi)酰胺酶陽性為PPNG。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PPNG和TRNG檢出率、各地同一藥物的耐藥率、低敏率等計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 淋球菌對各監(jiān)測藥物MIC結(jié)果 詳見表1。

表1 100株淋球菌對7種抗生素耐藥結(jié)果分布（株）

2.2 淋球菌對7種抗生素耐藥結(jié)果 詳見表2。

表2 100株淋球菌對7種抗生素耐藥結(jié)果統(tǒng)計(jì)（株）

2.3 PPNG和TRNG結(jié)果 100株淋球菌中檢出PPNG 46株，陽性率為46%（46/100）；檢出TRNG 35株，陽性率為35%（35/100）。

2.4 多重耐藥情況 100株淋球菌中檢出多重耐藥菌株80株：對環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素3種抗生素都耐藥的64株（64%），對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、阿奇霉素耐藥的3株（3%），對環(huán)丙沙星、青霉素、四環(huán)素、阿奇霉素耐藥的13株（13%）。全部菌株對環(huán)丙沙星、四環(huán)素耐藥。

3 討 論

本次研究顯示，淋球菌對青霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、阿奇霉素耐藥率遠(yuǎn)超過WHO規(guī)定的5%，提示這4種藥物不能作為治療淋病的首選藥。

青霉素耐藥率95%，高于廣州市2019年的耐藥率93%［7］，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.355，P＝0.552），與2008—2014年廣州市耐藥率（87%）［8］相比，耐藥率上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.249，P＝0.022），與其他地區(qū)數(shù)據(jù)相比，高于廣西省［8］（86.81%）（χ2＝3.938，P＝0.047）、江蘇省（78.98%）［9］（χ2＝12.442，P＝0.000）。可見廣州市淋球菌對青霉素持續(xù)高度耐藥，有逐步上升趨勢，值得我們繼續(xù)關(guān)注。PPNG檢出率46%，和廣州市之前數(shù)據(jù)相比，并未增長（2019年廣州市PPNG 35%，χ2＝2.510，P＝0.113；2008—2014年廣州市PPNG 36%，χ2＝3.660，P＝0.054）。TRNG檢出率35%，與廣州市2019年的檢出率32%、2008—2014年檢出率43%相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.202，P＝0.653；χ2＝2.254，P＝0.133），說明廣州PPNG和TRNG流行率顯平穩(wěn)態(tài)勢。

2020年度環(huán)丙沙星耐藥率最高，達(dá)到97%，與廣西省（98.90%）［9］、江蘇省（99.36%）［10］報(bào)道一致，且80株多重耐藥菌株全部對環(huán)丙沙星耐藥。

阿奇霉素是WHO、美國疾病預(yù)防控制中心及歐洲的治療指南中推薦與頭孢曲松聯(lián)用治療淋病的藥物［11］。我國淋球菌耐藥監(jiān)測的資料顯示，2013—2016年我國淋球菌分離株對阿奇霉素耐藥的比例達(dá)18.6%［11］，阿奇霉素不宜作為一線推薦藥物。本次試驗(yàn)阿奇霉素耐藥率為16%，與我國報(bào)道接近。這說明淋球菌的耐藥性在不同的地區(qū)各不相同，淋病的治療方案要根據(jù)各地區(qū)的耐藥情況制定。

頭孢曲松、頭孢克肟和大觀霉素都未見耐藥菌株，頭孢曲松、頭孢克肟低敏率分別為4%、11%，與2019年的頭孢曲松、頭孢克肟低敏率（4%、19%）相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.000，P＝1.000；χ2＝2.510，P＝0.113）。

淋病患病率男性、女性差別大，大約5∶1［1］。本次研究的淋球菌耐藥株全部來自男性患者，有可能女性癥狀不明顯被漏診，應(yīng)引起臨床醫(yī)生重視，對女性患者應(yīng)做淋球菌培養(yǎng)或者核酸檢測。

綜上所述，淋球菌對大觀霉素的敏感性最高，其次是頭孢曲松和頭孢克肟，這3種藥物仍是治療淋病的首選藥，但在其他地區(qū)對頭孢菌素、大觀霉素耐藥均有報(bào)道，因此耐藥監(jiān)測需持續(xù)進(jìn)行。青霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、阿奇霉素耐藥率高且出現(xiàn)多重耐藥，已不能作為一線藥物治療淋病，但是其耐藥機(jī)制傳播情況仍是監(jiān)測重點(diǎn)。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。