下調環狀RNA circ-BTG2對腎癌細胞增殖和遷移的影響及其機制

趙云飛 徐祖偉 黃耿 桂定文 姜衛東 付金倫 彭偉 萬京樺鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）泌尿外科 45000；腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室，黃石 45000；武漢科技大學職業危害識別與控制湖北省重點實驗室 40065

腎癌是世界范圍內最常見的泌尿系統腫瘤之一，發病率及病死率呈逐年升高［1］?；蛑委熓悄I癌研究的新方向。環狀RNA（circRNA）是一類保守的小分子序列，呈閉環結構，能夠有效調控基因的表達，導致細胞生物學行為發生變化［2］。腎癌與circRNA的異常表達直接相關，circRNA在腎癌的發生和發展中產生重要影響［3］。目前僅有少部分circRNA在腎癌中的作用得到了證實，使得以circRNA為靶點的靶向治療成為了腎癌研究者共同關注的重點［4］。circ-BTG2是一種新發現的circRNA，circ-BTG2在腎癌中的作用及機制并不清楚。本研究通過實驗研究下調circ-BTG2對腎癌細胞生物學性狀的影響及具體機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 腎癌786-O細胞株購于上海中科院細胞庫；實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）相關試劑盒購于日本TaKaRa公司；circ-BTG2抑制劑（GATAACAGGGTAACGCTGTCT）和無義對照序列由廣州市銳博生物科技有限公司合成；轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX購于美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國Corning公司；一抗購于美國BD公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑盒和二甲基亞砜購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2 細胞培養和分組 786-O細胞培養在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養基，培養條件為5%CO2、37℃。將對數生長期786-O細胞接種至24孔板，依據Lipofectamine RNAiMAX的說明將無義對照序列和circ-BTG2抑制劑轉染，命名為對照組和實驗組。

1.3 qRT-PCR檢測circ-BTG2和Grb2協同結合蛋白2（Grb2-associated binding protein-2，GAB2）信 使RNA（mRNA）的表達 選擇Trizol試劑提取786-O細胞總RNA，進一步合成cDNA，依據qRT-PCR相關試劑盒的說明進行擴增。使用2-ΔΔCt方法計算相對表達量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 MTT法檢測細胞活性 取對數生長期的轉染后786-O細胞，分別以5×103個/孔接種96孔板，連續5 d MTT檢測。每孔分別加入MTT溶液，培養箱孵育3.5 h。采用移液器吸去溶液，每孔分別加入二甲基亞砜，在振蕩器上快速震蕩30 min。在490 nm波長處，利用酶標儀檢測細胞的吸光度（A）值。

1.5 Transwell遷移實驗檢測786-O細胞遷移能力 取對數生長期的轉染后786-O細胞，采用不含FBS的RPMI 1640培養基重懸786-O細胞，以1×104個/孔接種于Transwell上室，在下室加含血清的RPMI 1640培養基。培養24 h。利用甲醇固定、結晶紫染色，利用棉簽擦去未穿過微孔膜的786-O細胞，在光學顯微鏡（×100）下拍照、計數。

1.6 Western blotting檢測GAB2蛋白和AKT/mTOR信號通路蛋白表達 取對數生長期的轉染后786-O細胞，依據蛋白提取試劑盒說明書分別提取各組786-O細胞總蛋白，設定電泳參數，在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠中電泳以分離蛋白，采用電轉法將分離后的蛋白轉至聚偏二氯乙烯膜。利用10%的脫脂牛奶進行封閉。采用適量封閉液制備一抗，在4℃孵育12 h。洗膜后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗羊抗兔，室溫下孵育1.5 h，滴加發光液，利用凝膠成像系統曝光、顯影。

1.7 統計學方法 利用SPSS 17.0統計學軟件對所有數據進行統計分析，計量資料符合正態分布，以（±s）表示，兩組間比較均采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 qRT-PCR檢測轉染后786-O細胞中circ-BTG2的表達 在786-O細胞株中，對照組與實驗組中circ-BTG2表達 量 分 別 為（1.70±0.20）和（0.44±0.09），實 驗 組circ-BTG2表達被明顯抑制（t＝5.69，P＜0.01），見圖1。

圖1 轉染陰性對照無義序列（對照組）及circ-BTG2抑制劑（實驗組）后786-O細胞中circ-BTG2的表達

2.2 MTT法檢測轉染后786-O細胞增殖情況 MTT分析結果顯示，與對照組786-O細胞相比，實驗組786-O細胞轉染circ-BTG2后第2天開始，786-O細胞的增殖水平下降（t＝3.86，P＜0.05），見圖2。

圖2 circ-BTG2對786-O細胞增殖情況的影響

2.3 Transwell遷移實驗檢測轉染后786-O細胞的遷移情況 Transwell遷移實驗分析顯示，對照組和實驗組遷移786-O細胞數分別為（94.91±15.34）個和（25.48±6.60）個，實驗組遷移細胞數明顯減少（t＝4.16，P＜0.01），這表明circ-BTG2可導致786-O細胞遷移能力明顯降低，見圖3。

圖3 circ-BTG2對786-O細胞遷移情況的影響（×100）

2.4 qRT-PCR檢測轉染后786-O細胞中GAB2 mRNA的表達 在786-O細胞株中，對照組與實驗組中GAB2 mRNA表達量分別為（2.86±0.24）和（1.27±0.18），實驗組GAB2 mRNA表達被明顯抑制（t＝5.25，P＜0.01）。

2.5 Western blotting檢測GAB2蛋白和AKT/mTOR信號通路蛋白的表達 與對照組786-O細胞相比，實驗組786-O細胞中GAB2蛋白表達明顯降低，AKT/mTOR信號通路蛋白如p-AKT蛋白、p-mTOR蛋白表達明顯降低，見圖4。

圖4 Western blotting檢測GAB2蛋白及AKT/mTOR信號通路蛋白相對表達

3 討 論

circRNA廣泛存在于動植物細胞內，直接影響細胞的分化、增殖、發育等生物學功能［5］。越來越多的circRNA被證實在腎癌中異常表達，在腎癌的發生、發展中起到了非常重要的調控作用［6］。Sun等［7］報道，circ-SCARB1在腎癌組織和細胞系中升高，敲除circ-SCARB1抑制細胞增殖、遷移和侵襲，同時誘導細胞凋亡，miR-510-5p是circ-SCARB1的靶標。Liu等［8］報道，腎癌細胞系和組織中circPTCH1表達上調，其高水平表達的患者生存率降低，circPTCH1可在體外和體內誘導腎癌細胞遷移和侵襲能力增加。circ-BTG2是一種新發現的長鏈非編碼RNA（lncRNA），circ-BTG2在腎癌細胞中作用及機制尚未見報道。

本研究顯示，下調circ-BTG2能夠抑制腎癌細胞的增殖和遷移，表明circ-BTG2高表達可能參與腎癌的發生和發展。GAB2蛋白由1 870個氨基酸構成，其在多種惡性腫瘤如卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌中存在過量表達，與腫瘤的分期、分級相關，沉默GAB2蛋白可顯著抑制腫瘤細胞的增殖和轉移［9-10］。Mu等［11］報道，miR-218通過抑制GAB2蛋白表達抑制腎癌細胞的惡性生物學行為，GAB2在腎癌中表現為癌基因作用。本研究結果表明，下調circ-BTG2可明顯抑制GAB2基因的表達。AKT/mTOR信號通路在腎癌細胞的惡性轉化中發揮關鍵作用［12］。GAB2蛋白表達被抑制后，AKT/mTOR信號通路蛋白表達明顯降低，表明AKT/mTOR信號通路被抑制。

綜上所述，本研究證實過表達circ-BTG2有助于抑制腎癌細胞的增殖和侵襲，其具體機制可能與抑制GAB2基因表達相關。circ-BTG2的深入研究可能為腎癌的基因治療提供新的突破口。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。