lncRNA SNHG15-210通過上調CDKN1A對宮頸癌SIHA細胞增殖的影響

鮑群麗 萬淑瓊 黃耿 汪宏良 柯俊 尚小玲鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）檢驗科 45000；鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）婦科 45000；鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）泌尿外科 45000

宮頸癌是世界上女性發病率較高的惡性腫瘤之一，復發率高且較易轉移，嚴重威脅女性健康［1］。研究宮頸癌的發病機制，為宮頸癌治療提供有效的分子靶點是目前臨床和基礎研究的熱點。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類非編碼單鏈RNA，長度超過200個核苷酸［2］。lncRNA在肺癌、膀胱癌、宮頸癌、黑色素瘤等各種腫瘤中表達上調或下調，與腫瘤細胞的分化、增殖、侵襲等行為有關［3］。研究發現，SNHG15-210是一種由953個核苷酸組成的lncRNA，其在甲狀腺癌中發揮抑癌因子作用［4］。SNHG15-210對宮頸癌細胞的作用尚未明了。本研究主要研究SNHG15-210對宮頸癌細胞增殖的影響及其作用機制，以期為宮頸癌的靶向治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 宮頸癌細胞SIHA購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；CCK-8試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司；DMEM培養基購于美國Gibco公司；pcDNA-NC、pcDNA-SNHG15-210質粒購于上海吉瑪制藥技術有限公司；實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒購于大連寶生物公司；Opti-MEM培養基、Lipofectamine 3000購于美國Life Technologies公司；結晶紫購于美國Sigma公司；一抗、辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G（IgG）二抗購于美國CST公司。

1.2 細胞培養和轉染 將SIHA細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱內。將對數生長期SIHA細胞接種于24孔板，根據Lipofectamine 3000試劑說明書將pcDNA-NC、pcDNA-SNHG15-210質粒轉染入SIHA細胞，分別記為NC組和SNHG15-210組，轉染48 h后檢測各組細胞的轉染效率。

1.3 qRT-PCR檢測SNHG15-210、細胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑1A（CDKN1A）信使RNA（mRNA）表達 采用TRIzol試劑提取SIHA細胞RNA，合成cDNA后按照qRT-PCR試劑盒說明書進行反應，引物序列如下。CDKN1A引物正向序列：5’-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3’，反 向 序 列：5’-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3’；GAPDH引物正向序列：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 序 列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；SNHG15-210引物正向序列：5’-GGGACCTGACCTGAGAGAAGAT-3’，反向序列：5’-GGTGCCAAGGCTTGCATTCA-3’。以GAPDH為SNHG15-210和CDKN1A mRNA的內參基因，按照2-ΔΔCt法計算SNHG15-210、CDKN1A mRNA的表達。

1.4 CCK-8法檢測SIHA細胞增殖情況 將處理后的SIHA細胞制成單細胞懸液，按照每孔3×103個接種至96孔板，每孔加入25μl CCK-8試劑，培養4 h，于酶標儀檢測波長在450 nm處的吸光度（OD）值。每組采用4個復孔，分別在第1天、第2天、第3天、第4天進行CCK-8法檢測，實驗重復4次。

1.5 集落形成實驗檢測SIHA細胞增殖能力 將處理后的SIHA細胞制成單細胞懸液，按照每孔3×103個接種至6孔板，培養10 d后，用甲醇溶液固定細胞，用0.1%結晶紫溶液染色，用流水洗去殘余染液，觀察并計數集落形成數。每組采用4個復孔，實驗重復4次。

1.6 Western blot檢測CDKN1A蛋白的表達 向處理后的SIHA細胞中加入細胞裂解液，提取總蛋白，取50μg蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳和轉膜，用5%脫脂牛奶封閉3 h，分別加入稀釋后的一抗孵育過夜，加入IgG二抗孵育2 h，加入ECL顯影液顯影、拍照。

1.7 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料符合正態分布，均以均數±標準差（±s）表示，組間比較應用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組SIHA細胞中SNHG15-210的表達 如圖1，SIHA細胞轉染24 h后，NC組和SNHG15-210組SIHA細胞中SNHG15-210的表達分別為（1.14±0.37）和（11.69±2.62），SNHG15-210組相比NC組上調了10.25倍（t＝3.99，P＜0.01）。

圖1 NC組和SNHG15-210組中SNHG15-210的表達

2.2 SNHG15-210對SIHA細胞增殖活性的影響 與NC組相比，SNHG15-210組SIHA細胞在第2、3、4天時增殖活性均有下降趨勢（均P＜0.05），表明SNHG15-210過表達抑制宮頸癌SIHA細胞增殖活性（圖2）。

圖2 高表達SNHG15-210對SIHA細胞增殖能力的影響

2.3 SNHG15-210對SIHA細胞集落形成能力的影響 NC組和SNHG15-210組集落形成數分別為（162.30±14.92）個和（61.55±12.31）個，差異有統計學意義（t＝5.21，P＜0.01），提示SNHG15-210過表達可抑制宮頸癌SIHA細胞的集落形成（圖3）。

圖3 SNHG15-210對SIHA細胞集落形成的影響

2.4 SNHG15-210對CDKN1A mRNA表達的影響 如圖4，NC組和SNHG15-210組SIHA細胞中CDKN1A mRNA的 表 達 分 別 為（1.02±0.11）和（6.23±1.16），表 明SNHG15-210可升高CDKN1A mRNA的表達（t＝4.50，P＜0.01）。

圖4 SNHG15-210對SIHA細胞CDKN1A mRNA表達的影響

2.5 SNHG15-210對CDKN1A蛋白表達的影響Western blot結果（圖5）表明，與NC組相比，SNHG15-210組SIHA細胞CDKN1A蛋白表達增加，細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和Cyclin D2表達降低。

圖5 高表達SNHG15-210對SIHA細胞CDKN1A蛋白表達的影響

3 討 論

研究發現，lncRNA異常表達與宮頸癌的發生、發展密切相關［5］。lncRNA如PTCSC3［6］、PTENP1［7］可通過上調抑癌基因的表達，降低宮頸癌的增殖、遷移和侵襲能力。lncRNA如SOX2OT［8］、EWSAT1［9］可通過上調癌基因的表達，促進宮頸癌的發生和發展。Liu等［4］研究顯示，SNHG15-210在甲狀腺癌組織和細胞中表達下調，與患者臨床分期、腫瘤大小、遠處轉移相關，SNHG15-210過表達可抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，SNHG15-210在甲狀腺癌中起腫瘤抑制作用。SNHG15-210在宮頸癌細胞中的作用尚不明了。本研究顯示，過表達SNHG15-210可明顯抑制宮頸癌SIHA細胞的增殖能力，SNHG15-210在宮頸癌細胞中表現為抑癌因子作用。

CDKN1A蛋白是一種細胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑，通過與細胞周期蛋白依賴蛋白激酶相結合，負性調控細胞周期的進展［10］。CDKN1A蛋白在誘導腫瘤細胞DNA修復、凋亡、衰老等發明發揮重要作用［11］。CDKN1A蛋白在宮頸癌組織中的表達低于癌旁組織，上調CDKN1A基因表達可明顯抑制宮頸癌細胞的增殖［12］。本研究顯示，過表達SNHG15-210后SIHA細胞中CDKN1A基因表達顯著增加，提示SNHG15-210可促進CDKN1A的表達。本研究顯示，SNHG15-210促進CDKN1A表達后，SIHA細胞中細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和Cyclin D2表達降低，表明SIHA細胞的增殖活性降低。

綜上所述，SNHG15-210可能通過促進CDKN1A基因表達抑制宮頸癌細胞的增殖活性，提示SNHG15-210有望成為宮頸癌治療的潛在靶點。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。