lncRNA SNHG15-210通過(guò)上調(diào)CDKN1A對(duì)宮頸癌SIHA細(xì)胞增殖的影響

鮑群麗 萬(wàn)淑瓊 黃耿 汪宏良 柯俊 尚小玲鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）檢驗(yàn)科 45000；鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）婦科 45000；鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）泌尿外科 45000

宮頸癌是世界上女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)率高且較易轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅女性健康［1］。研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌治療提供有效的分子靶點(diǎn)是目前臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸［2］。lncRNA在肺癌、膀胱癌、宮頸癌、黑色素瘤等各種腫瘤中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、侵襲等行為有關(guān)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，SNHG15-210是一種由953個(gè)核苷酸組成的lncRNA，其在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌因子作用［4］。SNHG15-210對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用尚未明了。本研究主要研究SNHG15-210對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，以期為宮頸癌的靶向治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 宮頸癌細(xì)胞SIHA購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；CCK-8試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；pcDNA-NC、pcDNA-SNHG15-210質(zhì)粒購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司；結(jié)晶紫購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G（IgG）二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將SIHA細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SIHA細(xì)胞接種于24孔板，根據(jù)Lipofectamine 3000試劑說(shuō)明書將pcDNA-NC、pcDNA-SNHG15-210質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SIHA細(xì)胞，分別記為NC組和SNHG15-210組，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)SNHG15-210、細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑1A（CDKN1A）信使RNA（mRNA）表達(dá) 采用TRIzol試劑提取SIHA細(xì)胞RNA，合成cDNA后按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反應(yīng)，引物序列如下。CDKN1A引物正向序列：5’-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3’，反 向 序 列：5’-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3’；GAPDH引物正向序列：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 序 列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；SNHG15-210引物正向序列：5’-GGGACCTGACCTGAGAGAAGAT-3’，反向序列：5’-GGTGCCAAGGCTTGCATTCA-3’。以GAPDH為SNHG15-210和CDKN1A mRNA的內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCt法計(jì)算SNHG15-210、CDKN1A mRNA的表達(dá)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)SIHA細(xì)胞增殖情況 將處理后的SIHA細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按照每孔3×103個(gè)接種至96孔板，每孔加入25μl CCK-8試劑，培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm處的吸光度（OD）值。每組采用4個(gè)復(fù)孔，分別在第1天、第2天、第3天、第4天進(jìn)行CCK-8法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.5 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIHA細(xì)胞增殖能力 將處理后的SIHA細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按照每孔3×103個(gè)接種至6孔板，培養(yǎng)10 d后，用甲醇溶液固定細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，用流水洗去殘余染液，觀察并計(jì)數(shù)集落形成數(shù)。每組采用4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.6 Western blot檢測(cè)CDKN1A蛋白的表達(dá) 向處理后的SIHA細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，取50μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉3 h，分別加入稀釋后的一抗孵育過(guò)夜，加入IgG二抗孵育2 h，加入ECL顯影液顯影、拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組SIHA細(xì)胞中SNHG15-210的表達(dá) 如圖1，SIHA細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，NC組和SNHG15-210組SIHA細(xì)胞中SNHG15-210的表達(dá)分別為（1.14±0.37）和（11.69±2.62），SNHG15-210組相比NC組上調(diào)了10.25倍（t＝3.99，P＜0.01）。

圖1 NC組和SNHG15-210組中SNHG15-210的表達(dá)

2.2 SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞增殖活性的影響 與NC組相比，SNHG15-210組SIHA細(xì)胞在第2、3、4天時(shí)增殖活性均有下降趨勢(shì)（均P＜0.05），表明SNHG15-210過(guò)表達(dá)抑制宮頸癌SIHA細(xì)胞增殖活性（圖2）。

圖2 高表達(dá)SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞集落形成能力的影響 NC組和SNHG15-210組集落形成數(shù)分別為（162.30±14.92）個(gè)和（61.55±12.31）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝5.21，P＜0.01），提示SNHG15-210過(guò)表達(dá)可抑制宮頸癌SIHA細(xì)胞的集落形成（圖3）。

圖3 SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞集落形成的影響

2.4 SNHG15-210對(duì)CDKN1A mRNA表達(dá)的影響 如圖4，NC組和SNHG15-210組SIHA細(xì)胞中CDKN1A mRNA的 表 達(dá) 分 別 為（1.02±0.11）和（6.23±1.16），表 明SNHG15-210可升高CDKN1A mRNA的表達(dá)（t＝4.50，P＜0.01）。

圖4 SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞CDKN1A mRNA表達(dá)的影響

2.5 SNHG15-210對(duì)CDKN1A蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果（圖5）表明，與NC組相比，SNHG15-210組SIHA細(xì)胞CDKN1A蛋白表達(dá)增加，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和Cyclin D2表達(dá)降低。

圖5 高表達(dá)SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞CDKN1A蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5］。lncRNA如PTCSC3［6］、PTENP1［7］可通過(guò)上調(diào)抑癌基因的表達(dá)，降低宮頸癌的增殖、遷移和侵襲能力。lncRNA如SOX2OT［8］、EWSAT1［9］可通過(guò)上調(diào)癌基因的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。Liu等［4］研究顯示，SNHG15-210在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與患者臨床分期、腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，SNHG15-210過(guò)表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，SNHG15-210在甲狀腺癌中起腫瘤抑制作用。SNHG15-210在宮頸癌細(xì)胞中的作用尚不明了。本研究顯示，過(guò)表達(dá)SNHG15-210可明顯抑制宮頸癌SIHA細(xì)胞的增殖能力，SNHG15-210在宮頸癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌因子作用。

CDKN1A蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑，通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶相結(jié)合，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)展［10］。CDKN1A蛋白在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)、凋亡、衰老等發(fā)明發(fā)揮重要作用［11］。CDKN1A蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，上調(diào)CDKN1A基因表達(dá)可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖［12］。本研究顯示，過(guò)表達(dá)SNHG15-210后SIHA細(xì)胞中CDKN1A基因表達(dá)顯著增加，提示SNHG15-210可促進(jìn)CDKN1A的表達(dá)。本研究顯示，SNHG15-210促進(jìn)CDKN1A表達(dá)后，SIHA細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和Cyclin D2表達(dá)降低，表明SIHA細(xì)胞的增殖活性降低。

綜上所述，SNHG15-210可能通過(guò)促進(jìn)CDKN1A基因表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖活性，提示SNHG15-210有望成為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。