CNV-Seq技術在產前診斷胎兒Williams-Beuren綜合征中的應用

紀藝珍 許亞松

廈門大學附屬婦女兒童醫院廈門市婦幼保健院產前診斷科 363100

Williams-Beuren綜合征（WBS）的患病率估計在1/20 000～1/7 500之間。是一種罕見的由7q11.23微缺失引起的遺傳性疾病［1］。主要臨床表現為生長發育遲緩、輕中度智力低下（IQ 20～106不等）；行為上常表現為較高的社交能力、個性友善、焦慮、認知能力障礙、空間視覺構建能力缺陷；絕大多數患者伴有心血管異常，多為早期高血壓，先天性主動脈瓣上狹窄；特殊面容（包括頭型度長、眼距增寬、內眥贅皮、長人中、鼻孔朝前、嘴唇突出、眶周豐滿）；內分泌異常，包括糖耐量受損、糖尿病，1/3的患者伴有甲狀腺功能和結構異常；偶有患者伴有聲帶麻痹、高鈣血癥。廈門市婦幼保健院近年產前診斷發現2例胎兒WBS，現報道如下。

1 病例資料

1.1 臨床資料（1）例1，孕婦，29歲，孕1產0，孕婦平素月經規則，孕期順利，無特殊不適。無放射線、毒物、藥物接觸史，無抽煙、嗜酒史，無胎兒畸形家族史。否認近親結婚，否認輔助生殖。早孕期彩超提示胎兒頸項透明層（NT）1.3 mm，行胎兒染色體非整倍體檢測提示低風險。孕26周彩超提示胎兒雙頂徑、腹圍小于同孕周2個標準差，估計胎兒體質量560 g，小于同孕周第10百分位數；要求產前診斷就診本科。（2）例2，孕婦，30歲，孕3產1，生育過一個健康足月兒，人工流產1次。孕婦平素月經規則，孕期順利，無特殊不適。無放射線、毒物、藥物接觸史，無抽煙、嗜酒史，無胎兒畸形家族史。否認近親結婚，否認輔助生殖。早孕期彩超提示胎兒NT 1.36 mm，行產前血清學篩查低風險。孕26+1周彩超提示胎兒局部腸管回聲增強，胎兒永存左上腔靜脈，主動脈弓偏細（內徑約0.16 cm），左心偏小（左、右房室大小不對稱，左心房內徑0.9 cm，右心房內徑1.4 cm，左心室內徑0.6 cm，右心室內徑0.9 cm）；要求產前診斷就診本科。

1.2 檢測方法（1）G顯帶核型分析。超聲下進行臍血管穿刺術抽取臍血3 ml，取2 ml標本進行臍血細胞培養，按常規方法制片，G顯帶分析。同時采集胎兒父母的外周血進行常規的細胞培養和G顯帶分析。顯微鏡下計數20個中期分裂相，分析5個細胞核型，對異常核型增加分析數，根據人類細胞遺傳學國際（ISCN2016）命名體制描述染色體異常核型。（2）高通量低深度全基因組測序（CNV-seq）提取臍血及其父母外周血的基因組DNA，進行文庫構建；通過片段化-連接、聚合酶鏈反應（PCR）前純化、PCR擴增、PCR后純化一系列過程，利用Next Seq CN500高通量測序平臺行CNV-seq檢測，并進行測序分析，常規進行STR連鎖分析進行母血污染鑒定，測序結果發現的CNVs與國際基因組CNVs多態性數據庫DGV、表型數據庫和人類基因組數據庫UCSC進行比對及結果致病性分析及描述診斷。

1.3 檢測結果 染色體G顯帶結果顯示核型結果均為46，XN，核型無明顯異常。CNV-seq結果提示，病例1胎兒seq［GRch37］del（7q11.23 q11.23）chr7：g.72650120-74209678del，檢 出7q11.23q11.23區域約1.5Mb的缺失。病例2胎兒seq［GRch37］del（7q11.23 q11.23）chr7：g.72535448-74310510del；檢 出7q11.23q11.23區域約1.78 Mb的缺失。見圖1、2。

圖1 病例1胎兒低深度全基因組測序（CNV-seq）結果

2 討 論

WBS（OMIM 194050）是一種多系統性神經發育障礙，由跨越28個基因的7q11.23染色體上的1.5～1.8 Mb半合子缺失引起。其發病機制是由于在配子形成過程中的細胞分裂期，在細胞分裂的過程中染色體不能準確排列，染色體配對成分不能正常交叉重組。若父母為染色體平衡易位攜帶者，在減數分裂期間可因不平衡分離而形成染色體部分缺失的配子，在與另一正常配子受精后即形成雜合性缺失的合子［1-2］。99%的WBS為新發缺失變異，1%的病例由于父母其中一方的染色體平衡易位引發。7q11.23缺失區域內包含致病基因彈性蛋白基因（ELN）、LIM激酶1（LIMK1）、含GTF2I重復域1（GTF2IRD1）、普通轉錄因子2I（GTF2I）等25～27個基因的雜合性缺失，導致相應的臨床表型［3］。ELN基因的單倍型不足被證明是造成瓣膜主動脈狹窄和全身性動脈病等心血管疾病的原因，少數較大或較小缺失的病例報道跨越著絲粒或端粒區域，其中多數包括ELN基因。而LIMK1，細胞質連接蛋白2（CLIP2），GTF2IRD1和GTF2I基因則被認為與特定的認知特征和顱面特征有關。Ferrero等［4］報道了1例智商正常的非典型7q11.23缺失患者。該病例在WBS基因組間隔中缺失約1 Mb。通過熒光原位雜交法（FISH）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術（qPCR）進行缺失定位，發現該患者在著絲粒和端粒兩側的重排都比經典的缺失短。細胞遺傳學和分子分析表明，先證者的缺失不包含了基因復制因子C2（RFC2），CLIP2，GTF2IRD1和GTF2I。而著絲粒斷裂點位于鎮靜域鄰接鋅指域1B（BAZ1B）基因的內含子3和4之間。Ashe等［5］發現在小鼠胚胎發生過程中，BAZ1B在顱神經衍生的間充質中強烈表達，從而驅動面部形態發生。編碼的蛋白質水平降低是一系列顱面特征的來源，類似于典型的WBS患者所顯示的特征，例如鼻梁上翹，鼻梁平坦，微乳頭畸形（或下頜骨發育不全），錯牙合畸形，顳葉狹窄和突出前額。GTF2IRD1基因的半合子性與WBS的面部特征和空間視覺構建能力（VSC）缺陷有關，而GTF2I基因的半合子性在WBS社交行為的發生中起著至關重要的作用。并且GTF2IRD1和GTF2I基因對于WBS認知功能至關重要。GTF2I，GTF2IRD1和GTF2IRD2屬于TFII-I基因轉錄因子家族。它們與多種蛋白質和DNA相互作用，因此可能影響廣泛的神經生理和發育過程。GTF2I充當基礎轉錄因子，與各種啟動子的啟動子元件結合，并響應上游信號事件，通過增強子處的E-box元件調節轉錄。GTF2IRD1可以結合與組織發育和分化有關的基因上游的調節元件。Enkhmandakh等［6］在動物實驗中通過對GTF2IRD1和GTF2I基因的完全敲除表明，這些基因雜合的小鼠通常生長遲緩，下頜骨發育不全，以及其他顱面缺陷，從側面反映了GTF2IRD1和GTF2I基因與WBS個體的特征性面部外觀和牙齒問題的相關性。Kopp等［7］研究發現在妊娠中期小鼠大腦中，GTF2IRD1結合的靶點富含轉錄和染色質調節劑和泛素介導物，而GTF2I結合的靶點富含信號傳導蛋白，包括磷酸化和WNT信號通路的調節劑。同時這些靶點富含突觸蛋白和轉錄調節劑，其中包含大量已知的自閉癥系譜障礙基因的染色質修飾劑。Chen等［8］研究發現紋狀體，海馬和杏仁核是胎兒發育早期和晚期7q11.23區段基因編碼蛋白與其相關因子之間相互作用的關鍵區域。此外該研究還發現GTF2I通過與DNA依賴性蛋白激酶催化亞基（PRKDC）和乳腺癌1型易感性蛋白（BRCA1）相互作用，在動態網絡中發揮關鍵作用。Zhang等［1］通過產前診斷SNP陣列分析了18例7q11.21區段從517 kb到605 kb的7q11.21微缺失的相似患者，并得出結論認為7q11.21缺失（chr7：64543313-65196780）可能是良性的，并且與人類疾病無關［1］。研究中該區域內包括ZNF92其余基因是假基因INTS4L1，INTS4L2和RSL24D1P3。所有胎兒均未顯示與ZNF92、INTS4L1、INTS4L2或RSL24D1P3相關的異常表型。

圖2 病例2胎兒低深度全基因組測序（CNV-seq）結果

目前檢測基因片段缺失的技術包括FISH、多重連接探針擴增技術、qPCR、染色體微陣列分析（CMA）、CNV-seq等［9-10］。與其他技術相比，CNV-seq檢測可以更加精確地在全基因組范圍內掃描檢測染色體的微缺失和微重復，分辨率高達30 kb。WBS患者的染色體缺失片段＜2 Mb，傳統的染色體G顯帶核型分析難以檢出，故診斷率較低，因此，國內關于此病的報道也較少。隨著CNV-seq檢測在產前診斷中的廣泛應用，越來越多的WBS患兒在產前可以明確診斷。產前超聲檢查發現胎兒結構異常是進行CNV-seq檢查的適應證［2］，應在胎兒染色體核型分析正常的基礎上進一步行CNV-seq檢測。吳東等［11］通過對7例WBS的研究發現最常見的超聲特征是宮內發育遲緩（82.35%）和先天性心血管異常（58.82%）。心血管缺陷的表現主要包括：瓣上主動脈瓣狹窄、室間隔缺損、主動脈縮窄和周圍肺動脈狹窄。因此在產前檢查中同樣需要提高對產前超聲檢查結果的認識和警惕性，關注WBS相關的超聲指標異常，作為進一步檢查確診WBS的重要線索和依據。

2例患兒父母染色體及CNV-Seq均正常，因而患兒屬于新發的微缺失。WBS為常染色體顯性遺傳性疾病，但幾乎所有患者的染色體變異是父親或母親生殖細胞形成、減數分裂中的新發突變，多為散發［12］。本病雖然發病率不高，但患兒可能會給家庭帶來嚴重的經濟與精神的雙重打擊，也給社會帶來沉重負擔，因此對此類胎兒一定要引起充分重視。對于既往此類不良孕史患者再次妊娠時建議做產前診斷，且采用分辨率達到能夠檢測該微缺失水平的檢測手段。本報道病例通過用CNV-seq技術在產前明確診斷出WBS，也進一步證實了CNV-seq技術作為一線技術應用在臨床的效果，真實有效地評價了該技術的診斷水平。