分子標志物預測甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移的價值△

劉春浩，趙豪，李小毅

中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院基本外科，北京 100730

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）約占所有甲狀腺惡性腫瘤的85%，近年來，其發病率迅速提高。通過規范的治療，PTC患者的預后較為滿意。在整個生命周期中，大多數患者面臨的主要問題是復發和再次手術。PTC中頸部淋巴結轉移率為20%～90%，以頸部中央區居多。淋巴結轉移是PTC患者制訂治療方案和提示預后的重要依據，也是患者復發率高、生存率低的重要危險因素。超聲檢查是較為常用且重要的頸部淋巴結評估手段，但是其頸部淋巴結轉移陽性預測值較低，容易漏診隱匿性淋巴結轉移。研究探討預測淋巴結轉移的因素，發現一些對淋巴結轉移有預測價值的臨床特征，如男性、年齡、多灶、腫瘤大小等，但是它們對于淋巴結轉移的預測價值仍不夠理想。因此，需要探索一種更有效的方法來幫助預測淋巴結轉移。目前研究顯示，某些基因的改變與淋巴結轉移相關，例如鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog，BRAF）基 因 、端 粒酶 逆 轉 錄 酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）和長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等。本文對PTC與淋巴結轉移相關的分子標志物進行綜述，以期對PTC淋巴結轉移的預測、診斷提供幫助。

1 BRAFV600E 基因突變與PTC淋巴結轉移

近年來，人們積極尋求預后分子標志物來改善PTC的風險分層，其中BRAF突變受到了最廣泛的關注。BRAF是PTC的一個主要致癌突變，PTC中BRAF基因突變率為29%～83%，在BRAF突變高發的地區韓國，PTC患者BRAF基因突變率在80%以上。研究表明，BRAF基因突變與PTC侵襲性臨床病理特征相關，且與PTC的復發明顯相關，其被認為是PTC預后的分子標志物。本文探討BRAF基因突變與PTC淋巴結轉移相關的機制及其預測價值。

BRAF基因突變主要通過激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路促進甲狀腺癌進展，相關信號分子激活大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）蛋白，與快速纖維肉瘤（rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF）蛋白激酶相互作用，其中B型RAF激酶即BRAF在RAF家族中含量最多、效力最強，激活的BRAF磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）1/2，MEK1/2依次磷酸化并激活兩個直接下游的細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2，ERK1/2隨后磷酸化下游蛋白，最終導致細胞核中涉及細胞增殖的各種基因表達改變，BRAF基因突變會促進這一信號通路的活性，從而促進腫瘤的發生和發展。（圖1）

圖1 BRAFV600E 基因突變介導PTC 細胞惡性行為的作用機制

韓國的一項回顧性研究中共納入3107例PTC患者，結果顯示，BRAF基因突變率為81.4%，淋巴結轉移率為42.4%，BRAF基因突變組和未突變組淋巴結轉移率分別為43.9%（1111/2530）和35.9%（207/577），差異有統計學意義（P＜0.01）；在腫瘤直徑為2.0～4.0 cm的PTC患者中，BRAF基因突變率為81.0%（188/232），淋巴結轉移組與非轉移組BRAF基因突變率分別為85.0%和69.5%，多因素分析提示BRAF基因突變是中央區淋巴結轉移的獨立預測因子（OR=3.494，P=0.002）。在另一項回顧性研究中共納入977例甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarcinoma，PTMC）患者，結果顯示，BRAF基因突變率為40.1%，淋巴結轉移率為23.4%，在BRAF基因突變且腫瘤直徑＞0.5 cm的患者中，單因素（OR=1.76，P=0.05）和多因素（OR=1.96，P=0.03）分析均顯示BRAF基因突變與淋巴結轉移顯著相關。Zhang等的薈萃中，共納入16 936例PTC患者，分析淋巴結轉移與BRAF基因突變的關系，其中BRAF基因突變型患者中46.5%（5281/11 359）發生淋巴結轉移，BRAF野生型患者中33.3%（1858/5577）發生淋巴結轉移，提示BRAF基因突變是淋巴結轉移的風險因素（OR=1.67，P=0.004）。但是，也有相關研究顯示BRAF基因突變對于淋巴結轉移沒有預測價值。雖然上述韓國研究提示在腫瘤直徑為2.0～4.0 cm的PTC患者中BRAF基因突變與淋巴結轉移相關，但在腫瘤直徑為0.5～1.0 cm的PTC患者中，淋巴結轉移組與非轉移組BRAF基因突變率差異不大（85.5%vs 81.5%，P=0.047），多因素分析亦未顯示BRAF基因突變與淋巴結轉移相關（OR=1.232，P=0.163）；在其他腫瘤直徑中，也未發現BRAF基因突變與淋巴結轉移相關。而且，Chen等研究也未發現BRAF基因突變與淋巴結分期相關，在373例PTC患者中BRAF基因突變型和野生型患者N分期分別為46.9%和51.3%，N分期分別為53.1%和48.7%，差異均無統計學意義（P＞0.05）；多因素分析亦未發現BRAF基因突變與淋巴結分期相關（OR=1.797，P=0.109）。

從上述臨床研究可以看出，雖然大樣本的臨床研究提示BRAF基因突變與PTC淋巴結轉移相關，BRAF基因突變組有更高的淋巴結轉移率，但是BRAF基因突變組和野生組之間的淋巴結轉移率差別不大。此外，并無研究發現BRAF基因突變與淋巴結轉移存在相關性，因此，其預測PTC淋巴結轉移的價值需進一步探討。

2 RAS基因突變與PTC淋巴結轉移

RAS位于BRAF的上游，是一個鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）結合蛋白家族，通過MAPK和磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路調控細胞生長。RAS家族由三個高度相關的成員KRAS、HRAS和NRAS組成，是有核細胞生長、增殖和分化過程的重要調節因子。由BRAF基因突變引起下游效應通路的激活，最終導致異常的細胞增殖、遷移和侵襲，從而促進腫瘤的惡性表現。（圖2）

圖2 RAS 基因突變介導PTC 細胞惡性行為的作用機制

濾泡型甲狀腺乳頭狀癌（follicular variant of papillary thyroid carcinoma，FVPTC）是一種常見的甲狀腺癌類型，占所有PTC的15%～20%，而RAS突變PTC的主要病理類型為FVPTC。Yip等的研究連續檢測了1510例甲狀腺癌患者基因譜，其中RAS突變患者323例（31%），在RAS突變的PTC患者中87%（270/312）為FVPTC，而經典型甲狀腺乳頭狀癌（classical variant of papillary thyroid carcinoma，CVPTC）僅為3%（9/312）。與兩項小樣本的研究結果相似，RAS突變PTC中FVPTC分別為74%和96%。Yu等比較了21 796例CVPTC患者和10 740例FVPTC患者的臨床病理特征，發現FVPTC患者的淋巴結轉移率明顯低于CVPTC患者（16%vs 34%，P＜0.01）。Giani等的研究同樣發現FVPTC患者淋巴結轉移率明顯低于CVPTC患者（9.1%vs 25.7%，P＜0.01）。Yip等的研究數據進一步提示RAS突變的PTC淋巴結轉移率低于BRAF突變的PTC（12.8%vs 72.7%），而CVPTC是BRAF突變的常見類型。由此可見，RAS基因突變常見的FVPTC促進腫瘤轉移可能主要通過其他方式來實現，如血行轉移，而非淋巴結轉移，這與臨床中RAS突變常見的FVPTC血行轉移多見情況類似。因此，RAS基因突變對于FVPTC的淋巴結轉移預測價值有限。

3 TERT 啟動子突變與PTC淋巴結轉移

TERT基因是位于5號染色體上的一個35 kb基因，其通過多種遺傳和表觀遺傳改變來影響端粒酶活性，在腫瘤形成中起著關鍵性作用。TERT啟動子突變可導致E-twenty-six（ETS）轉錄因子家族新的堿基對結合位點，ETS家族成員中激活的GA結合蛋白轉錄因子亞基α（GA binding protein transcription factor subunit alpha，GABPA）與GA結合蛋白轉錄因子亞基β（GA binding protein transcription factor subunit beta，GABPB）在TERT啟動子突變位點結合，激活TERT，進而促進PTC細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，TERT啟動子區域的甲基化也在腫瘤惡性行為方面發揮著重要作用，PTC復發患者的TERT啟動子甲基化顯著高于腫瘤未復發患者，而且TERT啟動子甲基化與淋巴結轉移、TNM分期晚有關。這些研究提示TERT啟動子區域的突變或甲基化能夠促進PTC的惡性行為，導致腫瘤遷移和侵襲增加。（圖3）

圖3 TERT 啟動子區域突變與促進PTC 惡性行為的作用機制

一項173例TERT啟動子突變型和1587例TERT啟動子野生型患者的薈萃分析結果顯示，TERT啟動子突變型和野生型患者分別有53.18%和37.30%出現淋巴結轉移，TERT啟動子突變與淋巴結轉移之間存在顯著相關性（OR=1.76，P=0.01）。Yang等研究中，TERT啟動子突變率為10.6%（1027/9653），與PTC淋巴結轉移顯著相關（OR=1.64，P＜0.05）。這些研究提示TERT啟動子突變能夠促進PTC的淋巴結轉移。但是也有研究未發現TERT啟動子突變與PTC淋巴結轉移相關，一項共納入330例TERT啟動子野生型和12例TERT啟動子突變型PTC患者的研究中未發現TERT啟動子突變與淋巴結轉移相關，較野生型患者，TERT啟動子突變型患者的中央區淋巴結轉移率[83.3%（10/12）vs 65.1%（215/330），P=0.190]、側頸區淋巴結轉移率[75.0%（9/12）vs 49.0%（152/330），P=0.078）]、淋巴結轉移數目＞5個[50.0%（6/12）vs 31.8%（106/330），P=0.190]均無顯著增加。雖然如此，但由于研究中突變組較少的病例數量，其結果的可靠程度仍需進一步驗證。

從TERT啟動子突變的致病機制到PTC患者臨床病理數據，均高度提示TERT啟動子突變患者的淋巴結轉移率發生風險更高，因此對于這類患者，應采取更積極的治療，包括預防性頸淋巴結清掃術。

4 RNA與PTC淋巴結轉移

許多腫瘤基因組突變存在于不編碼蛋白質的區域內，這些區域通常轉錄成lncRNA，lncRNA是一類沒有任何編碼能力的調節RNA分子，長度超過200個核苷酸，在多種腫瘤中調節腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小的非編碼RNA，以序列導向的方式負調控靶mRNA的穩定性和（或）翻譯，以減少靶蛋白的表達，多年來已被證明在腫瘤發生發展中發揮著重要作用。環狀RNA是有限蛋白質編碼潛力的共價閉環結構，不能被RNA外切酶降解，從而維持它們在細胞中廣泛穩定表達，其調節紊亂后可能導致腫瘤的發生。目前研究已經發現lncRNA能夠通過多種機制促進PTC細胞的惡性行為，如增殖、遷移和侵襲等，通過miRNA介導的機制是其主要的促瘤機制，多種miRNA已被發現在PTC的惡性行為中發揮著調節作用。研究人員發現，lncRNA和miRNA能夠通過增強上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）來促進PTC的進展，EMT是介導腫瘤細胞轉移的重要機制，這一過程的增強可能導致PTC主要的轉移（淋巴結轉移）增加。此外，環狀RNA作為一組調節因子，與miRNA相互作用，抑制其表達和功能，從而在多種疾病中發揮調節作用。相關研究提示ABHD11-AS1、HOXD-AS1、長基因間非編碼RNA 02454（long intergenic non-protein coding RNA 02454，LINC02454）、小核仁 RNA 宿主基因 3（small nucleolar RNA host gene 3，SNHG3）、AGAP2簇反義 RNA 1（AGAP2 cluster antisense RNA1，AGAP2-AS1）、LINC00460、LOC389641、n384546、lncRNA癌癥候選易感物9（cancer susceptibility 9，CASC9）高表達患者的陽性淋巴結或總淋巴結轉移率高于低表達者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。一項502例PTC患者的研究中顯示，LOC389641高表達組PTC淋巴結轉移率明顯高于低表達組[56.2%（141/251）vs 32.3%（81/251），P＜0.01）]。Chen 等的研究結果顯示，LINC00460高表達組淋巴結轉移率是低表達組的近10倍[43.3%（11/26）vs 4.8%（1/22），P＜0.01]。目前也有少量臨床研究發現，其他類型的RNA與PTC淋巴結轉移相關。circ_0001666、circ_0002111、circ_0122683和circ_0008274高表達患者的陽性淋巴結或總淋巴結轉移率高于低表達者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。從這些研究可以看出，lncRNA的表達水平高低與PTC淋巴結轉移之間存在相關性，尤其是LOC389641和LINC00460等，似乎展現了與淋巴結轉移更密切的關系，值得進一步的探索。此外，不少環狀RNA的表達也與PTC淋巴結轉移之間存在相關性。當然，由于不同研究在患者選擇方面可能存在的偏倚、研究病例數的不同及RNA表達水平判斷界值的差別，可能會影響研究結果，造成不同研究結果之間的差異，后續研究應注意這些問題。（圖4）

圖4 lncRNA與PTC 惡性行為之間的關系

5 DNA甲基化與PTC淋巴結轉移

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，指的是甲基（CH）添加到胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸（CpG）胞嘧啶的5'位置，基因啟動子區域的高甲基化可以失活腫瘤抑制基因，也可以激活致癌基因，DNA甲基化通過調控靶基因表達在腫瘤進展中發揮重要作用。

Guan等在38例PTC患者樣本中檢測了23個DNA修復基因啟動子的甲基化水平，結果發現3個DNA修復基因啟動子區發生高甲基化，分別為人MutL 同 源 蛋 白 1（human MutL homologue 1，hMLH1）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶（8-oxoguanine DNA glycosylase，OGG1）。與非甲基化組相比，hMLH1基因甲基化組的PTC淋巴結轉移率明顯增高[63.0%（5/8）vs 10.0%（3/30），P=0.0049]。但是，也有研究發現基因低甲基化水平與淋巴結轉移相關，Park等在120例PTC患者樣本中檢測3個DNA甲基化標記物水平（cg10705422、cg17707274、cg26849382），來反映3個基因的甲基化水平，即與CasL2相互作用的分子（molecules interacting with CasL2，MICAL2）、基質金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinases 7，MMP7）、透明相關甲型蛋白1（Diaphanous-related formin 1，DIAPH1），探討它們與淋巴結轉移的關系。結果顯示，與高甲基化水平的患者相比，合并3個基因低甲基化水平的PTC患者更易出現淋巴結轉移[70.0%（70/103）vs 6.3%（1/17），P＜0.01]和疾病復發[23.3%（24/103）vs 0（0/17），P=0.022]，提示這3個基因低甲基化水平與PTC淋巴結轉移和復發相關。雖然目前研究DNA甲基化與PTC淋巴結轉移研究的病例數量較少，但是上述研究仍舊看到了不同的甲基化水平與其對照組之間的淋巴結轉移率存在差別，值得進一步探索。

綜上所述，PTC中一些常見的重要基因突變，如BRAF基因和TERT啟動子突變，與PTC淋巴結轉移率存在相關性，但是現有的數據顯示它們仍不能準確區分PTC淋巴結轉移與未轉移患者。部分研究提示，某些lncRNA表達水平不同的患者的淋巴結轉移率存在明顯差別，值得進一步探索。