MicroRNAs在特發性肺纖維化中的作用研究進展

徐文豪，李萬成 (.成都市第一人民醫院，四川 成都 60000；.成都醫學院第一附屬醫院，四川 成都 60000)

MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一類長度約20～24個核苷酸的功能性非編碼單鏈小RNA,是由具有發夾結構的約70～90個堿基組成的pre-miRNA經過Dicer酶剪切產生,miRNAs與目標 mRNA 的 3'非編碼區(3'URT)相結合,抑制翻譯過程或降解目標mRNA,從而抑制相關基因的表達,具有調節多細胞多種生物學功能的作用[1-3]。一個miRNA可以作用于多個靶點，多個miRNA也可以共同調控一個基因的表達[4]。

特發性肺纖維化(IPF)是一種慢性、進展性、纖維性間質性肺疾病,病變部位局限于肺部,其肺組織學和胸部高分辨率CT表現與一般間質性肺炎相似。IPF的病理生理機制是各種原因導致肺泡上皮細胞破壞，從而引起趨化因子、蛋白酶、TGF-β等導致纖維化的細胞因子釋放,成纖維細胞和肌成纖維細胞激活、聚集,肺泡上皮細胞向間質轉化，細胞外基質大量沉積,最終肺實質破壞、被纖維組織替代,引起呼吸衰竭,確診后中位生存期為3至5年[5]。肺纖維化發病率、患病率以及死亡率正逐年上漲[6]。

目前肺纖維化的機制尚不十分明確，許多研究表明miRNAs在IPF的發病過程中起重要作用。miR-21在IPF模型小鼠肺組織和IPF患者的肺中顯著上調，miR-21參與了肺的纖維化過程[7]。Yang等[8]發現在IPF模型小鼠和IPF患者成纖維細胞中miR-31的表達減少,而將miR-31引入肺內可顯著減輕模型鼠的肺纖維化,表明miR-31c是IPF發病機制中的重要調節因子,可能成為治療IPF患者的潛在靶點。

近年來研究表明microRNAs(miRNAs)在IPF的發生發展中起重要作用,參與了肺纖維化過程中的肺上皮修復、上皮-間充質轉化(EMT)、成纖維細胞活化、肌成纖維細胞分化、巨噬細胞極化、肺泡上皮細胞(AECs)衰老和膠原生成。miRNA表達中的長非編碼RNA(LncRNAs)和miRNAs之間的相互作用以及miRNA與DNA甲基化的相互作用在IPF過程中起重要調控作用。本文就miRNAs在IPF中的作用的最新研究進展作一系統綜述。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1 miRNAs與肺上皮修復

AEC損傷后本應該由上皮細胞更頻繁的增殖從而修復損傷，但上皮細胞的增殖是有限度的，頻繁損傷或大的損傷后上皮細胞增殖不夠，從而成纖維細胞會參與異常修復的過程，從而導致肺纖維化。而這種過度的損傷將會導致的上皮修復不良負反饋激活成纖維細胞產生大量細胞外基質[9]。研究表明,IPF患者AECs中miR-29c表達下調,IPF動物模型AECs中的miR29c表達降低導致細胞凋亡增加,上皮更新減少,而miR-29c過表達作用于Foxo3a靶點導致AECs大量增殖、存活率提高,從而使體內纖維化減少[10]。Ge等[11]的研究發現，miR-323a-3p在IPF患者的AECs中比對照組降低12.5倍，博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠肺上皮細胞miR-323A-3p的表達也下降，使用miR-323a-3p模擬物可以抑制小鼠肺纖維化,而使用miR-323A-3p的拮抗劑可以促進肺纖維化，而這一過程可能是miR-323a-3p作用于Smad2減弱轉化生長因子(TGF)-β信號以及抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA的表達有關。有證據表明,在IPF發展過程中,AECs中的miR-30a表達下降,而人為上調miR-30a可抑制依賴DRP-1的線粒體分裂而抑制AECs-Ⅱ凋亡,miR-30a可以通過堿基配對和3'非翻譯區的互補位點來調節DRP-1啟動子的羥甲基化，從而抑制TET1的表達，最終抑制肺纖維化[12-13]。

2miRNAs與EMT

EMT參與了胸膜間皮細胞(PMC)的遷移和胸膜下肺纖維化的形成,在博萊霉素處理的PMC中miR-18a-5p的表達下調,PMC的EMT增加,進一步研究表明,IPF模型小鼠中miR-18a-5p過度表達,作用于TGF-β受體Ⅱ的3'UTR區阻止博萊霉素誘導的PMC的EMT，從而抑制博萊霉素誘導的胸膜下纖維化[14]。有證據表明,miR-200家族(miR-200a、miR-200b和miR-200c)過表達,可抑制TGF-β1誘導的EMT,并且可以逆轉特發性肺纖維化的病理過程[15]。Yamada等[16]人報道，在IPF的發展過程中，miR-21在肺上皮細胞中的表達上調促進了EMT的發生。HMGA2是EMT過程中的一個關鍵因素,Liang等[17]的研究表明,IPF模型小鼠中miR26a的表達下調作用于HMGA2可以促進EMT過程。Wang等[18]的研究也表明，miR-221靶向作用于HMGA2,通過調節TGF-β1/Smad3誘導的EMT可抑制博萊霉素誘導的肺纖維化。

3 miRNAs與成纖維細胞活化

研究表明，miR-27b過表達通過靶向作用于TGF-β受體1和Smad3,減少膠原和α-平滑肌肌動蛋白的表達,從而減輕肺纖維化[19]。miR-29在成纖維細胞抵抗凋亡的機制中被認為是細胞外基質(ECM)的調節因子。通過對轉染miR-29c模擬物和miR-29c抑制劑的研究表明，TGF-β可下調miR-29c和Fas受體的表達，抵抗細胞凋亡[20-12]。研究證實，在特發性肺纖維化發生發展過程中，miR-29a的下調導致LOXL2和SERPINH1的過度表達[22]。因此上調miR-29不但可以抑制細胞外基質分泌,而且可以恢復肺成纖維細胞對凋亡的敏感性,從而減少肺纖維化。

4 miRNAs與肌成纖維細胞分化

Cui等[23]研究表明，與對照組相比，在肺纖維化患者的肺成纖維細胞中TGF-β1誘導的miR-27A-3p表達降低,miR-27A-3p的過表達抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化,而敲除miR-27A-3p后肌成纖維細胞表型標志物α平滑肌肌動蛋白表達增加,Smad2和Smad4作用增強,從而促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化。Yang等[24]發現在TGF-β誘導的肺成纖維細胞和IPF患者的肺組織中,miR145表達上調，在肺成纖維細胞中轉染miR145模擬物可促進α-平滑肌肌動蛋白的表達,并促進局灶性粘連和纖維性粘連的形成，進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，然而,miR-145表達陰性的小鼠不易被博萊霉素誘導為肺纖維化。由此可見，miR-27A-3p和miR-145可能通過促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化，從而促進肺纖維化。

5 miRNAs和巨噬細胞

巨噬細胞極化在人類疾病的發病機制中起著重要作用,而巨噬細胞極化受多種轉錄因子調控,STAT1負責M1極化,STAT6負責M2激活,IL-4和IL-13通過激活STAT6通路從而促進M2極化[25]。IL-4和IL-13可誘導巨噬細胞上調miR-142-5p的表達，通過靶向STAT6磷酸化的負調控因子SOCS1，從而延長STAT6磷酸化，IL-4和IL-13可誘導巨噬細胞下調miR-130a-3p的表達，解除其對PPARγ的抑制,從而協調STAT6信號轉導。抑制miR-142-5p和增加miR-130a-3p可調節巨噬細胞促纖維化的能力,從而抑制博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化[26]。

6 miRNAs與細胞衰老

研究表明,細胞衰老在IPF的發生發展中起著重要作用。AEC衰老的機制以及AEC衰老在IPF病理中的作用尚不清楚。有證據表明miR-34a、miR-34b和miR-34c可能是與細胞衰老有關,這些miRNAs在IPF患者的Ⅱ型AECs中顯著上調。另一份研究表明,miR-34a在人和小鼠肺成纖維細胞中都顯著上調,并且miR-34a基因敲除后會比野生型動物發生更嚴重的肺纖維化[27]。有趣的是，肺成纖維細胞中miR-34a的增加導致肺成纖維細胞的衰老表型，因為miRNA促進衰老標志物的表達，激活β半乳糖苷酶活性，并抑制細胞增殖。綜上所述，紊亂的miR-34a通過負反饋機制促進肺成纖維細胞的衰老，從而在IPF的發病機制中抑制肺纖維化過程[28]。

7 miRNA和TGF-β1信號轉導

研究表明TGF-β1可促進上皮間質轉化、成纖維細胞激活聚集,細胞外基質沉積最終導致肺纖維化,TGF-β1信號通路是介導肺纖維化的關鍵因素[29]。在肺纖維化模型中，TGF-β1誘導WISP1表達，miR-92a可逆轉TGF-β1誘導的WISP1表達，而miR-92a基因敲除可增加WISP1的表達，表明miR-92a可通過調節TGF-β1誘導的WISP1在肺纖維化中的表達，從而影響肺纖維華，這將有助于我們尋找新的IPF診斷和治療靶點[30]。Das等[31]發現，miR-326可以調節TGF-β1的表達，并且在肺纖維化中miR-326的水平與TGF-β1的蛋白水平呈負相關，轉染miR326模擬物可以抑制TGF-β1的表達,減輕肺纖維化,提示該miRNA對肺纖維化的發生、發展有一定的調節作用。此外,miR-326還可以直接下調促纖維化基因Ets1、Smad3和基質金屬蛋白酶(MMP)9,而上調抗纖維化基因Smad7。

8 miRNA和膠原的產生

IPF的特征是成纖維細胞異常增生,過度分泌Ⅰ型膠原沉積在肺泡壁,從而影響肺泡細胞的通氣功能,引起呼吸功能障礙。Hansen等[32]發現IPF中miR-29c的表達減少,而Ⅰ型膠原的表達增加,表明miR-29c可能通過影響Ⅰ型膠原而影響IPF的發病。Khalil等[33]進一步研究表明,IPF成纖維細胞中蛋白磷酸酶(PP)2A的功能異常低下,導致組蛋白脫乙酰化酶(HDA)C4磷酸化,miR-29c降低,而過表達HDAC4可以恢復miR-29c的水平,并抑制Ⅰ型膠原的產生。

9 miRNA表達的調控機制

長非編碼RNA(Long Non-Coding RNAs，LncRNAs)影響miRNA的表達。lncRNAs廣泛分布于哺乳動物體內，是一類具有200多個堿基的RNA分子，其功能類似于RNA，幾乎沒有蛋白質編碼能力[34]。大多數lncRNAs是由RNA聚合酶II催化的，但它們的序列保守性較差，在組織和細胞中具有很強的特異性[35]。最近的研究表明,lncRNAa參與了許多重要的調控過程,如基因組印跡、染色質修飾、X染色體沉默、轉錄激活、轉錄干擾和核轉運,這些調控作用也引起了廣泛的關注。有證據表明,lncRNAs在多個水平上參與細胞分化和個體發育調節,并與人類疾病密切相關,但目前尚不清楚lncRNAs是否參與IPF[36]。Huang等[37]利用IPF中表達異常的miRNAs,包括let-7d、miR-21、miR-29、miR-31、miR-101和miR-199,共鑒定出34個與這些miRNAs具有潛在結合位點的lncRNA,其中4個lncRNAs與這些紊亂的miRNAs呈負相關,沉默lncRNA CD99P1可抑制肺成纖維細胞增殖和α-平滑肌肌動蛋白的表達,敲除lncRNAn341773可以增加肺成纖維細胞膠原表達,以上發現提示CD99P1和n341773參與了IPF的發病機制,lncRNAs和miRNAs的相互作用在IPF的發病機制中起重要作用,是IPF發病機制研究的新方向。

miRNA之間相互作用影響miRNA的表達。每個miRNA可以有多個靶基因，多個miRNA也可以調控同一個基因。這個復雜的調控網絡可以是幾個miRNA的組合來精細調控一個基因的表達，也可以通過miRNA之間的相互調控來從而影響疾病的病理過程。Liang等[38]發現，Lin28B通過抑制Let-7d促進EMT，而抑制LIN28B則可以抑制TGF-β1誘導的肺纖維化和EMT。有趣的是，Lin28B是miR-26a的直接靶標之一，增加miR-26a可以通過抑制Lin28B而從而增強let-7d的表達，表明Lin28B介導了miR-26a對let-7d的調控作用。本研究提出了一種新的miRNA調控途徑，即一種miRNA與另一種miRNA相互作用可影響IPF的發病機制。

miRNAs和DNA甲基化的相互作用影響miRNA的表達。miRNA啟動子可能存在于DNA甲基化位點,miRNAs也可能通過抑制DNA甲基轉移酶(DNMT)參與DNA甲基化機制。在IPF患者的肺活檢和肺成纖維細胞中,miR-17～92的表達明顯低于對照組，而miR-17～92啟動子的DNMT 1表達和甲基化程度顯著高于對照組。結合其他數據，可以肯定在肺纖維化中，miR-17～92和DNMT 1之間存在一個新的表觀遺傳反饋環[39]。

10 結論與展望

miRNAs在IPF的發病機制中也發揮著重要作用。許多研究表明miRNA模擬物或抑制劑對多種人類疾病具有治療效果。不幸的是雙鏈RNA穩定性很差，極易被RNase等酶修飾失去治療作用。一些核酸藥物由于特定的分子機制,如天然免疫反應的激活,目前也無法用于臨床治療。最近,Yamaada等[40]開發了一種新型的miR-29b模擬物,它類似于“PNK-RNA”和“PSH-RNA”，并且這種新穎的RNA平臺結構不僅可以適用于miR-29b，而且可以適用于所有的miRNAs。這種新型的模擬RNA“miR-29b PSH-Match”對博萊霉素誘導的小鼠肺間質纖維化有明顯的治療作用，吸入miR-29b PSH-Match可用于IPF患者的治療。這種新型miRNA藥物的出現有著極其重要的價值，通過人們對miRNA的進步一步研究，miRNA藥物可能為治療IPF最有效的方式。

對部分miRNAs的研究表明,miRNAs參與了生命過程中的一系列重要過程,包括細胞增殖、凋亡、細胞死亡、脂肪代謝和細胞分化。根據我們的綜述,miRNAs在IPF患者的血液和肺組織中差異表達,并與IPF的發病機制密切相關。此外,miRNAs被證實參與IPF的病理機制,如肺上皮修復、EMT、成纖維細胞激活、肌成纖維細胞分化、巨噬細胞極化、AEC衰老和膠原生成等。此外,在IPF的病理過程中,許多因素被認為是miRNA異常表達的調節器。這些調節因子可以通過影響特異性miRNAs的表達來影響IPF的發病。這些發現提示miRNAs可能是IPF的診斷和治療靶點,也是IPF疾病預后的指標。miRNAs可能成為一種全新的治療IPF疾病的方法。