木霉菌拌種對小麥生長和根際真菌群落的影響

扈進(jìn)冬, 隋麗娜, 吳遠(yuǎn)征, 魏艷麗, 李紀(jì)順*

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省科學(xué)院生態(tài)研究所, 山東省應(yīng)用微生物重點實驗室, 濟(jì)南 250103;2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院, 濟(jì)南 250353)

小麥?zhǔn)鞘澜缰饕闹骷Z作物之一，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計2018年全球小麥產(chǎn)量8.65億t(www.fao.org/faostat 2020年11月16日數(shù)據(jù))，產(chǎn)量占世界谷物產(chǎn)量的1/3，在中國2018年收割面積2 451萬hm2，僅次于印度，但產(chǎn)量約1.3億t，占全球產(chǎn)量的15.18%，位居世界第一位。山東省是中國小麥的主產(chǎn)區(qū)，約占全國小麥產(chǎn)量的18.8%(國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部數(shù)據(jù))。然而隨著近年秸稈還田等耕作措施技術(shù)推廣應(yīng)用，病原真菌菌源在土壤中連續(xù)積累，小麥紋枯病、根腐和莖基腐病等土傳病害危害不斷加重[1-3]，尤其在小麥-玉米連作區(qū)常年發(fā)病較重，這些病害在小麥灌漿期導(dǎo)致枯白穗，嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量[4-6]對中國小麥的安全生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅[7-10]。在這些土傳病害中，鐮孢菌病原體對穗頭的感染可能導(dǎo)致谷物的霉菌毒素污染，已有研究發(fā)現(xiàn)，在人工條件下小麥莖干上鐮孢菌病原體的感染可以導(dǎo)致麥頭中霉菌毒素的積累[11]，直接影響食品安全。

當(dāng)前小麥土傳病害主要以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，其中種子處理被認(rèn)為是最有效的防治措施，但化學(xué)農(nóng)藥的功效主要發(fā)揮在小麥生長的早期，而無法在持續(xù)生長階段保持其有效性[12-13]。木霉菌是一種重要的生物殺菌劑，已廣泛用于植物病原真菌的生物防治[14]，并在對小麥土傳病害的防治中展現(xiàn)了優(yōu)越的前景[15-17]，已研究發(fā)現(xiàn)木霉菌可影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和組成，減低小麥根際土壤中病原真菌的相對含量，推測這種作用可能是木霉防治土傳病害的重要機制[18]。在先前研究中，研究組從2 000余株木霉菌株中篩選獲得了4株生防木霉菌(KZ23367、KZ23617、LTR-2和QT21990)，對引起小麥紋枯病、根腐病和莖基腐病的幾種病原菌具有一定的抑制作用，同時表現(xiàn)出較好的促進(jìn)植物生長作用。在盆栽試驗中通過小麥包衣處理，對小麥的生長和產(chǎn)量顯示了積極的影響。本研究中，通過檢測這些木霉菌包衣麥種后促進(jìn)小麥生長和調(diào)節(jié)小麥根際真菌群落的作用，用以評估這些木霉菌在當(dāng)前耕作模式下防治土傳病害、提高小麥產(chǎn)量的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種：濟(jì)麥44，山東魯研種業(yè)有限公司提供。

木霉菌：深綠木霉(Trichodermaatroviride)KZ23367、KZ23617、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)LTR-2和QT21990由本實驗室分離保存。

1.2 實驗設(shè)計

試驗田塊位于山東省德州市陵城區(qū)神頭鎮(zhèn)西辛莊村山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司實驗站，田塊地勢平坦，土壤類型為棕壤，肥力中上等，pH=7.5，土壤堿解氮含量31.15 mg/kg，有效磷含量38.41 mg/kg，速效鉀含量168.5 mg/kg，有機質(zhì)含量在1.57%左右，土壤含水量適中，小麥種植前茬作物為玉米，收獲后全部粉碎并還田處理。播種前施用硫酸鉀復(fù)合肥(N、P2O5、K2O質(zhì)量比為17∶17∶17，金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司)600 kg/ha作為基肥，返青拔節(jié)期追施尿素225 kg/ha(魯西化工集團(tuán)股份有限公司)，播種量112.5 kg/ha，機械播種。實驗時間2019年10月8日—2020年6月16日。

試驗采用的小麥品種為濟(jì)麥44，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種，對小麥莖基腐病易感。四株木霉菌均制備成每克含2億活孢子的拌種劑(含1%羥甲基纖維素鈉和1.5%海藻酸鈉，載體為200目麥飯石粉)。試驗設(shè)5處理3重復(fù)，處理1：木霉LTR-2拌種；處理2：木霉KZ23367拌種；處理3：木霉KZ23617拌種；處理4：木霉QT21990拌種；處理5空白對照不拌種(為含1%羥甲基纖維素鈉和1.5%海藻酸鈉的麥飯石粉)。拌種用量為100 g制劑拌10 kg種子；小區(qū)長8 m，寬1.5 m，面積12 m2，每處理3重復(fù)。

1.3 植物生長和產(chǎn)量分析

在拔節(jié)階段(出苗后150 d，3月7日)，從每個樣地中隨機選擇5點，每樣點隨機選取5株麥苗，挖出根系，測量株高、根長、鮮重、分蘗等。株高是指從地面到葉最高點的自然距離。成熟期采用小區(qū)收割機對小區(qū)所有植株進(jìn)行收割記錄實際產(chǎn)量。

1.4 土壤樣品收集

采樣方法：小區(qū)隨機5點取樣，每樣點隨機選取5株麥苗，挖出根系，用抖根法采集附著在根際表面的土壤，混勻后為該樣點的根際土壤樣品，將土壤樣品過20目細(xì)篩，取0.3 g根際土壤，按DNeasy PowerSoil Kit (QIAGEN, USA) 土壤微生物DNA提取試劑盒的試驗步驟，提取土壤微生物總DNA，-20 ℃保存。

1.5 定量PCR分析

用引物ITS1F5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和ITS2R 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’定量真菌豐度[19]，確定小麥根際土壤中總真菌群落豐度，以含有釀酒酵母的18SrRNA基因的質(zhì)粒的10倍稀釋液產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(基因拷貝數(shù)范圍為3 000～3.0×107)。采用三步方案進(jìn)行qPCR反應(yīng)：在95 ℃ 10 min； 95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)反應(yīng)；循環(huán)結(jié)束后，樣品加熱到95 ℃，立刻降至60 ℃ 保持5 s，然后每5 s提高0.5 ℃遞增到95 ℃，建立熔解曲線。qPCR反應(yīng)體系(20 μL)：包括10 μL 2×SG Fast qPCR Master Mix預(yù)混液(生工生物工程(上海)股份有限公司)，20 μM正向和反向引物各1 μL，DNF Buffer 2 μL，5 μL分子級水和1 μL土壤樣品DNA。所有熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR) 反應(yīng)均進(jìn)行三次重復(fù)。通過熔解曲線分析檢查PCR產(chǎn)物的特異性，擴(kuò)增效率為91.25%(R2=0.995)。

1.6 小麥紋枯病和莖基腐病調(diào)查

1.7 Illumina MiSeq測序和序列預(yù)處理

選擇15個DNA樣本(5個處理×3個重復(fù)樣本)用于真菌群落分析。PCR擴(kuò)增選取真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS基因的ITS2區(qū)，使用帶Barcode序列的引物對ITS3 AATTCCAGCATCGATGAAGAACGCAGC和ITS4 TNTCCTCCGCTTATTGATATGC[22]進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后對其產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物Qubit2.0定量，根據(jù)測定DNA濃度將樣品等比例混合均一化形成測序文庫，在上海生工生物工程股份有限公司Illumina MiSeq測序儀進(jìn)行測序。

將原始的真菌群落ITS基因測序讀段使用QIIME(V1.8.0)處理[23]，并根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元 (operational taxonomic units,OTU)，使用uparse軟件(v7.1)，將剩余高質(zhì)量序列以97%的相似度聚類到OTU中[24]，最后，選用Unite數(shù)據(jù)庫[25]進(jìn)行blastn比對獲得帶物種分類信息的OTU表。使用mothur(v1.39.5)[26 ]計算真菌群落的α多樣性。刪除了測序結(jié)果中屬于植物類群的序列，從而得到了15個樣品的723 265個讀數(shù)(每個樣品平均48 217個讀數(shù))。為了獲得等效的測序深度以用于以后的分析，將OTU表所有樣品稀疏為39 077個序列。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用R軟件agricolae包進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過鄧肯氏復(fù)極差檢驗確定(P<0.05)木霉菌拌種后對小麥幼苗生長的影響、對病害的防治效果和產(chǎn)量的影響。使用R軟件中的ggplot2和ggpubr軟件包的箱型圖展示木霉處理后對真菌群落的影響，并估算了小麥根際土壤中真菌群落的香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)以及OTU數(shù)量與小麥產(chǎn)量之間的線性相關(guān)性[27]。

2 結(jié)果

2.1 不同木霉菌拌種處理對小麥幼苗生長的影響

從表1可以看出不同的木霉拌種后對小麥的出苗影響不同，其中哈茨木霉LTR-2出苗率最高為93.67%，與出苗率最差的菌株哈茨木霉QT21990相比具有顯著差異(P<0.05)，但與其余幾個處理之間差異不顯著；鮮重方面深綠木霉KZ23367和哈茨木霉LTR-2的鮮重最高分別為5.27g/株和5.33g/株，與空白和其余兩株木霉間具有顯著性差異(P<0.05)；對于分蘗數(shù)來說，除深綠木霉KZ23617分蘗數(shù)有所降低外，其余的處理之間無顯著差異，但深綠木霉KZ23367和哈茨木霉LTR-2相較空白對照略有增加；對于株高木霉與對照之間無顯著性差異。綜合上述幾個指標(biāo)來看，哈茨木霉LTR-2拌種以后對小麥幼苗生長具有良好的促進(jìn)作用。

表1 木霉拌種對小麥出苗率、幼苗的鮮重、分蘗和株高的影響

2.2 不同木霉拌種處理對小麥紋枯病和莖基腐病的防治效果及產(chǎn)量的影響

播種后180 d對小麥紋枯病和莖基腐病的調(diào)查結(jié)果(表2)表明通過拌種處理，4種木霉菌，都顯著降低了小麥的白穗率(P<0.05)，從對小麥的紋枯病和莖基腐病的調(diào)查情況來看，引起小麥莖基腐病病害發(fā)生明顯高于紋枯病，此外，在病害調(diào)查過程中枯白穗的莖基部多呈現(xiàn)褐色病斑，拔出時極易從基部折斷，也印證了這一點，說明小區(qū)試驗過程中的白穗主要是莖基腐病引起；從降低白穗率角度看，哈茨木霉LTR-2和QT21990效果最好，防效分別達(dá)到66.72%和66.92%，最終產(chǎn)量也最高分別為6 105.56 kg/ha和6 077.78 kg/ha，與對照相比具有顯著性差異(P<0.05)，其余2株木霉菌也可以降低小麥白穗率提高產(chǎn)量，但與空白對照相比不具有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果說明，木霉菌通過拌種可以降低了小麥的白穗率，提高小麥產(chǎn)量。

表2 木霉拌種對小麥紋枯病和莖基腐病的防治效果及產(chǎn)量的影響

2.3 不同木霉拌種處理對小麥根際土壤真菌群落豐富度和多樣性的影響

通過高通量測序發(fā)現(xiàn)木霉拌種影響了小麥土壤根際土壤真菌的群落的多樣性(圖1)，OTUs可以反映群落的豐富程度，木霉拌種后群落的豐富度較空白對照降低了[圖1(a)]，同時，OTU數(shù)量與小麥產(chǎn)量之間的呈負(fù)相關(guān)[圖1(d)]；香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)分別反映了群落的均勻度和優(yōu)勢度，是表征群落多樣性的重要指標(biāo)，木霉拌種后香農(nóng)指數(shù)較空白對照略有降低[圖1(b)]，香農(nóng)指數(shù)與小麥產(chǎn)量之間的呈負(fù)相關(guān)[圖1(e)]；辛普森指數(shù)與空白對照相比則有所升高[圖1(c)]，辛普森指數(shù)與小麥產(chǎn)量之間的呈正相關(guān)[圖1(f)]；猜測木霉拌種通過抑制病原真菌而降低了小麥根際土壤真菌群落的多樣性，同時促進(jìn)了小麥產(chǎn)量的提高。

灰色陰影表示95%置信區(qū)間

2.4 不同拌種處理對小麥根際土壤真菌不同類群結(jié)構(gòu)的影響

依據(jù)OUT表在門水平下的物種注釋結(jié)果進(jìn)行分類求和并計算平均值，得到各處理在門水平下的物種組成相對豐度，如圖2(a)所示；將各物種相對豐度乘以qPCR獲得的真菌總的ITS拷貝數(shù)即為該物種的絕對豐度值，如圖2(b)所示。通過圖2可以看出，不同木霉拌種處理與空白對照相比沒有明顯差異，但使用絕對豐度計算，木霉拌種后真菌群落的總體豐度較空白對照發(fā)生了明顯的下降，其中哈茨木霉LTR-2拌種與未拌種小麥相比根際土壤真菌群落豐度明顯降低，平均豐度僅為未拌種小麥根際真菌豐度的27.68%。在物種組成上，木霉拌種的根際真菌群落中，子囊菌門(Ascomycota)、芽枝霉門(Blastocladiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、毛霉門(Mucoromycota)真菌的絕對量都發(fā)生了明顯的降低，這也顯示了采用絕對豐度計算的群落組成和結(jié)構(gòu)比相對豐度的計算更為科學(xué)。

圖2 不同木霉拌種條件下小麥根際土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)(門水平)

3 討論及結(jié)論

木霉作為一種生防制劑已被越來越多地用于防治植物真菌病害，防治的常見病原菌包括灰霉病菌Botrytiscinerea，尖孢鐮孢Fusariumoxysporum，立枯絲核菌Rhizoctoniasolani等多種植物病原菌[28-29]。目前，已知木霉菌發(fā)揮生物防治功能的“經(jīng)典機制”包括與病原菌營養(yǎng)競爭、抗生作用和分泌胞壁降解酶等[30-32]。這些強大的拮抗功能是木霉菌株廣泛作為生物殺真菌劑的生物防治應(yīng)用基礎(chǔ)。除此之外，最近的一些報道表明木霉還可以增強植物生長過程中對非生物脅迫的耐受性[33]，部分原因是使植物根系生長改善，持水能力提高；對于生物脅迫能夠通過調(diào)節(jié)植物根內(nèi)活性氧(reactive nitrogen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)代謝、氧化還原平衡和能量流提高植物對病原菌的防御能力[34]。這些研究均顯示了木霉作為生防菌應(yīng)用的強大潛力，近年來，對植物微生物組的調(diào)控作為一種病原菌的生物防治策略成為研究熱點。木霉作為一種重要的生防菌其改變植物微生物組結(jié)構(gòu)和與植物相互作用已成為生防菌研究的熱點。

在本研究中，通過真菌ITS擴(kuò)增子測序分析了4株生防木霉拌種小麥后對小麥根際土壤真菌群落影響，發(fā)現(xiàn)木霉拌種后對小麥根際土壤的真菌群落產(chǎn)生了明顯的影響，首先是降低了真菌群落的豐富度和多樣性，結(jié)合qPCR真菌定量檢測發(fā)現(xiàn)，木霉拌種處理后小麥根際土壤中真菌總的含量明顯降低，尤其是哈茨木霉LTR-2降低幅度最大，同時發(fā)現(xiàn)對于小麥產(chǎn)量來說，與小麥真菌群落均勻度(香農(nóng)指數(shù))和豐富度(OTUs數(shù))呈反比，而與群落的優(yōu)勢度(辛普森指數(shù))呈正比，這些結(jié)果之間可以相互印證。因此，木霉菌具有降低根際土壤真菌總體豐度的功能，此外，通過木霉拌種改變了根際土壤真菌的結(jié)構(gòu)和組成，這些改變可能為小麥生長營造更為適合的微生態(tài)環(huán)境，從而促進(jìn)小麥增產(chǎn)，也為木霉菌作為拌種劑使用促進(jìn)小麥的增產(chǎn)提供了理論支撐。