液相色譜-串聯質譜法測定乳制品中四種常用香料

林正鋒，李實飛，黃杰英，禤開智，王朝政

（?？诤ｊP技術中心，海南?？?570311）

乳制品是非常重要的營養補充，是日常飲食的重要組成部分，對增強國民身體素質具有重要的意義，尤其是嬰幼兒乳粉作為嬰幼兒階段的主要營養來源，更是人們關注的重點[1?2]。香蘭素和乙基香蘭素具有強烈的奶香味，麥芽酚和乙基麥芽酚是廣譜香味增效劑，此四種香料廣泛用于各種具有奶香味的食品中[3?5]。乳制品中添加食用香精香料可以提高食品的風味，但長期食用添加香精的奶粉可能使新生兒對其產生依賴性，過量攝入會引發潛在的健康問題[6?7]，因此香精香料的超范圍及過量使用問題日益引起人們的關注[8?9]。國家衛計委發布實施的GB 2760-2014 《食品添加劑使用標準》中明確指出不得添加食用香料、香精有27 種食品，其中包括巴氏殺菌乳、滅菌乳、發酵乳、無水黃油、稀奶油和嬰幼兒配方乳粉等多種乳制品[10]。因此，建立靈敏度高、準確可靠的乳制品中4 種常用香料的檢測方法對乳制品質量安全監管具有重要意義。

目前，此四種化合物同時檢測的方法主要有分光光度法[11]，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）[12?13]，二維液相色譜法（two-dimensional liquid chromatography, 2DLC）[14]，氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）[15]，液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LCMS/MS）[16?17]等。其中，分光光度法和液相色譜法檢測限較高，多種乳制品中要求不得添加食用香精，較高的檢測限可能會導致低含量的添加樣品無法檢出；氣相色譜-質譜法分析時間較長；液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、特異性強、分析速度快等優點，廣泛應用于食品中香料物質的檢測[18?19]。然而，在LCMS/MS 分析中，基質效應嚴重影響定量分析的準確度和精密度，目前文獻報道LC-MS/MS 測定乳粉中四種常用香料化合物均存在較強的基質效應，需采用基質匹配曲線或者內標法進行定量分析[16?17]，大大增加了檢測成本，此外，前處理過程需要對凈化液進行濃縮，而揮發性較強的香料化合物在濃縮過程中易損失[20?21]。受酚類化合物可采用酸堿分配法凈化的啟發[22?23]，本文采用水-醚體系對乳制品樣品進行提取，經堿液反萃除去雜質后采用高靈敏度高選擇性的液相色譜串聯質譜分析四種化合物。通過研究不同比例堿醚比的堿液反萃醚相中的香料化合物，實現樣品凈化和富集同步進行，整個過程無需氮吹濃縮，避免揮發性較強的香料化合物在氮吹濃縮過程中損失，以期建立一種靈敏度高、簡便快捷、準確可靠的乳制品中四種常用香料的檢測方法，為相關部門建立相關測定標準提供參考，保障乳制品的質量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈、叔丁基甲醚 色譜純，美國TEDIA 公司；甲酸 色譜純，德國CNW 公司；鹽酸、氫氧化鈉、氨水、無水硫酸鈉 分析純，廣州化學試劑廠；麥芽酚（純度≥99%）、乙基麥芽酚（純度≥99%）、香蘭素（純度≥98%）、乙基香蘭素（純度≥98%） 美國Sigma 公司；乳制品樣品（包括嬰幼兒配方乳粉、煉奶、黃油、奶酪、鮮牛奶、純牛奶、稀奶油、酸奶等共15 份） 均購自?？谑斜镜卮笮统?。

色譜柱：HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm,2.5 μm） 、 BEH C18色譜柱（ 100 mm×2.1 mm,1.7 μm）、HLB 固相萃取柱（100 mg, 3 mL）、TQD 超高效液相色譜-質譜聯用儀 美國Waters 公司；PXA 固相萃取柱（150 mg, 6 mL） 迪馬公司；KQ3200DE 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；MS3 渦旋儀 德國IKA 公司；320 R 低溫離心機德國Hettich 公司；Advantage A10 超純水凈化儀美國Millipore 公司；Genevac EZ-2 型溶劑蒸發工作站 英國SP Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 奶粉、奶酪、煉奶、黃油等類固體乳制品：稱取2 g 試樣（精確至0.01 g），置于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL 50 ℃的水（黃油樣品置于100 ℃烘箱中加熱使之溶解，煉奶用4 mL 水溶解），3000 r/min 渦旋混勻2 min，40 ℃下超聲提取15 min，超聲頻率為37 kHz，再加入20 mL 叔丁基甲醚，3000 r/min 渦旋混勻3 min, 再加入10 g 無水硫酸鈉除水，3000 r/min 渦旋混勻2 min，9000 r/min離心3 min，吸取上清液10 mL 轉移至另一離心管中，再加入2 mL 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液反萃，3000 r/min 渦旋混勻1 min 后，3000 r/min 離心3 min，用移液器準確移取下層清液0.9 mL 至刻度試管中，加甲酸定容至1.0 mL 過0.22 μm 微孔濾膜，供液相色譜-質譜測定。

過柱凈化富集過程：吸取上清液5 mL 轉移至另一離心管，加入5 mL 0.2 mol/L 氫氧化鈉溶液反萃，去掉上清液，40 ℃下用 Genevac EZ2 溶劑蒸發工作站濃縮20 min，除去微量的叔丁基甲醚。

HLB 過柱方法：除醚后用鹽酸調節pH 至3.0，先后加入3 mL 甲醇，3 mL 超純水活化固相萃取柱，然后全部上樣，樣液體積約為4.5 mL，重力過柱后，用5 mL 純水淋洗，棄去淋洗液，接著用5 mL 注射器抽干，最后用1 mL 甲醇洗脫。

PXA 過柱方法：先后加入3 mL 甲醇，3 mL 超純水活化固相萃取柱，然后全部上樣，樣液體積約為4.5 mL，重力過柱后，分別用3 mL 5%氨水甲醇和3 mL 甲醇淋洗，抽干，最后用1 mL 5%甲酸甲醇洗脫。

巴氏殺菌乳、滅菌乳、發酵乳、稀奶油等液體乳制品，直接稱取5 g 試樣于50 mL 聚丙烯離心管中，再加入20 mL 叔丁基甲醚提取，后處理步驟同奶粉等樣品。

1.2.2 色譜-質譜條件 色譜柱：HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm, 2.5 μm, Waters）；流速：0.4 mL/min；進樣體積：3 μL；柱溫：30 ℃；流動相，A 相為甲醇，B 相為0.05%甲酸水，梯度洗脫程序為0～1.0 min，10%～25%A， 1.0～5.0 min， 25%A， 5.0～5.1 min，25%～60%A，5.1～6.0 min，60%A，6.0～6.1 min，60%～90%A， 6.1 ～7.0 min， 90%A， 7.0～7.1 min， 90%～10%A，7.1 ～8.0 min，10%A。

MS 條件：電噴霧正離子源（ESI+），毛細管電壓：3.0 kV，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑管溫度：350 ℃，霧化氣：150 L/h 氮氣，干燥氣：650 L/h 氮氣，碰撞氣：氬氣。掃描模式：多反應監測模式（MRM），具體條件見表1，帶星號離子為定量離子。

表1 四種化合物保留時間及質譜參數Table 1 Retention times and mass spectrum parameters for 4 compounds

1.3 數據處理

通過Masslynx 工作站及數據處理系統采集分析質譜圖，外標法定量。實驗結果采用平均值表示，每個實驗平行三次，采用Excel 2010 進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 色譜-質譜條件的優化

配制1 μg/mL 的混合標準溶液于進樣瓶中，采用儀器自動進樣進入質譜儀，在Masslynx 軟件中設置質譜條件，并對標準液進行離子調諧，根據響應穩定、信號強度較高、干擾少的碎片確定定量離子對和定性離子對，具體參數見表1。

本文比較了HSS T3 色譜柱和BEH C18色譜柱對四種化合物的分離效果，兩種色譜柱對四種化合物的分離效果見圖1。由圖1 可以看出，HSS T3 色譜柱對四種化合物的分離效果明顯優于BEH C18色譜柱，且峰形良好。尤其是對于麥芽酚和乙基麥芽酚的峰形和響應有很好的改善作用，這是由于T3 色譜柱可以更好地保留麥芽酚等極性較大的化合物。楊華梅等[16]采用BEH C18色譜柱分離四種化合物時存在香蘭素和乙基麥芽酚保留時間重疊嚴重的現象，而林仙軍等[24]采用HSS T3 色譜柱分離乙基麥芽酚和香蘭素時，兩種化合物可實現基線分離且峰形較好?？疾炝怂?乙腈和水-甲醇流動相體系對四種化合物的分析效果影響，發現以水-甲醇作為流動相時，四種化合物的響應明顯優于水-乙腈流動相體系。并在此基礎上考察了甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水對色譜峰的影響，發現添加甲酸后，質譜響應增強，0.05%甲酸水和0.1%甲酸水響應無明顯差別，故最終采用甲醇-0.05%甲酸水作為流動相，在此條件下，四種化合物色譜圖見圖1B。

圖1 兩種色譜柱分離效果比較Fig.1 Comparison of separate effect of two kinds of chromatographic columns

2.2 凈化富集方法的選擇

為了提高方法檢出限和準確度，需要對提取液進行富集及凈化，本文采用富集倍數同為5 倍的4 種方式對空白加標樣品進行處理，分別為：a.取5 mL叔丁基甲醚直接吹干后定容上機分析；b.取5 mL 叔丁基甲醚用5 mL 堿液反萃后調節pH 用HLB 富集；c.取5 mL 叔丁基甲醚用5 mL 堿液反萃后用PAX富集；d.取5 mL 叔丁基甲醚用1 mL 堿液反萃后調酸上機分析；結果發現，四種香料化合物在氮吹的過程中均有一定程度的損失，尤其是香蘭素和麥芽酚回收率低于80%。采用固相萃取柱富集時，微量的叔丁基甲醚會造成目標物大量損失，即使采用真空除去叔丁基甲醚后，麥芽酚回收率仍低于80%難以滿足要求。而采用堿液和叔丁基甲醚比例為1:5 進行反萃時四種化合物的回收率均大于90%，故最終采用的凈化富集方式為堿液反萃。不同處理下四種化合物回收率見表2。

表2 不同凈化富集方式四種香料化合物回收率Table 2 Recoveries of four flavor compounds by different purification and enrichment methods

麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素和乙基香蘭素均呈弱酸性，在高堿性條件下能形成離子狀態，使其在水中溶解性大大提高，可從醚相中提取出來[25]。考察了在不同堿液和叔丁基甲醚比例下，四種化合物的回收率和基質效應，由圖2 可以看出，當堿液和叔丁基甲醚比例低于1:5 時，四種化合物回收率超過90%，而堿液和叔丁基甲醚比例達到1:10 時，麥芽酚和乙基麥芽酚回收率大大降低。以陰性的奶粉基質按照方法進行提取，按相應的堿醚比例反萃得到的基質液配制50 ng/mL 濃度的標準品與純溶劑配制的50 ng/mL混合標準品的響應值進行比較考察其基質效應，基質效應（ME）=陰性樣品基質添加標準溶液的色譜峰面積/純溶劑配制標準溶液的峰面積）×100[26]。結果表明，隨著堿醚比例的降低，基質效應逐漸減弱，說明減少堿醚體積比可以有效去除雜質，當堿醚比例為1:1 和1:3 時，麥芽酚存在較強的基質抑制效應，而當堿醚比低于1:5 時，各項目的基質效應均在80%～100%之間。為獲得最大的富集倍數，提高方法的靈敏度，同時保證較好的回收率，最終采用堿液和叔丁基甲醚比例為1:5 進行反萃，可實現5 倍富集并獲得良好的凈化效果。

圖2 不同堿醚比例堿液萃取時目標物的回收率和基質效應Fig.2 Recoveries and matrix effects of target compounds using different ratios of alkali solution and MTBE

2.3 線性范圍和定量限

將混合標準溶液配制成系列標準溶液，（濃度范圍為2～100 ng/mL），在本方法所確定的實驗條件下進行分析，以定量離子峰面積為縱坐標，標準工作液濃度為橫坐標作圖建立標準曲線，四種化合物線性方程見表3，結果表明，四種化合物在2～100 ng/mL 范圍內線性決定系數均大于0.995。根據3 倍信噪比，并計入試樣量和定容體積，計算檢出限（limit of detection, LOD），定量限（limit of quantity, LOQ）則根據10 倍信噪比計算，結果見表3，從表3 中可以看出，乳粉等固體樣品中麥芽酚和乙基香蘭素定量限為2 μg/kg，乙基麥芽酚定量限為4 μg/kg，香蘭素定量限為8 μg/kg，均低于10 μg/kg。

表3 四種化合物線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of 4 compounds

2.4 基質效應

采用液質聯用分析復雜基質時通常存在基質效應，基質效應對檢測結果有重要影響[27]，因此需要考察本方法的基質效應。本實驗以陰性的8 種基質按照方法分別進行提取凈化，用得到的凈化液配制50 ng/mL 的標準品，每種做3 個平行，將得到的響應值的平均值和純溶劑配制的50 ng/mL 混合標準品的響應值進行比較，通過二者比值來評價基質效應，得出目標化合物在8 種基質中的基質效應。四種化合物在各種乳制品中的基質效應在80%～100%的范圍內，具體結果見表4。說明乳制品基質對四種化合物存在微弱的基質抑制效應，實際檢測過程中可采用溶劑配制曲線直接定量[26]。本方法基質效應低于水體系提取固相萃取柱凈化方法[16?17]，說明前處理取得了很好的凈化效果。這主要是因為加入大量的硫酸鈉形成鹽析使蛋白質沉淀，通過堿液反萃可有效去除脂肪等不溶于堿性水溶液的有機化合物雜質[22?23]，從而明顯降低基質效應，有助于更準確地定量。

表4 四種化合物在不同乳制品中的基質效應Table 4 Matrix effects of 4 compounds in different dairy products

2.5 加標回收實驗

在上述確定的色譜條件和前處理條件下，在未標注添加食用香精的不同基質中添加三個不同濃度水平的香料進行添加回收實驗，其平均回收率與精密度見表5，從表5 可以看出，四種化合物在各基質中三種濃度水平下，相對標準偏差在2.5%～11.9%，除煉奶和黃油外，其它基質中平均回收率在80.4%～104.8%之間，加標回收率和精密度均符合GB/T 27404-2008[28]的要求，整個結果表明本方法檢測穩定性較好。煉奶和黃油的回收率相對偏低，平均回收率在67.7%～84%之間，可能是由于煉奶基質較為粘稠，提取效率低，而黃油在加熱溶解過程中易造成目標物的損失，此兩種乳制品中四種香料化合物的測定應采用基質標準溶液進行校正。

表5 乳制品中四種化合物加標回收和相對標準偏差（n=6）Table 5 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 4 spices in dairy products（n=6）

2.6 與其它方法的比較

針對奶粉中四種香料化合物的檢測，將所建立的方法與文獻報道中的方法進行比較（表6），結果表明，此方法具有靈敏度高（檢出限為0.6～2.4 μg·kg?1），分析時間短，基質效應小等優點。

表6 本方法與文獻方法的比較Table 6 Comparison of methods from literature reports and this work

2.7 實際樣品分析

應用該方法對市售15 件乳制品樣品（4 份樣品標注添加食用香精，1 份奶粉樣品標注添加香蘭素）進行分析測定。檢測結果見表7，由表7 可知，標注添加食用香精樣品確實檢出了四種香料中的一種或多種，說明了此四種化合物在乳制品中的應用較為廣泛。需要注意的是，GB 2760-2014 規定發酵乳不得添加食用香精香料，但是有的乳制品生產企業按照GB 19302-2010[30]生產的酸奶配料表仍含有食用香精，此外，麥芽酚在多個未標注添加香精的乳制品中有檢出，而其它三種香料化合物在未標注添加香精均未檢出，可能是因為在乳制品熱加工過程中，發生美拉德反應生成麥芽酚[31?32]，不同樣品麥芽酚含量差異較大，應研究其內源性產生的麥芽酚水平以便制定合適的限量值以判斷是否有額外添加。

表7 實際樣品中4 種化合物含量的檢測結果Table 7 Analysis results of four compounds in actual samples

3 結論

建立了高效液相色譜-串聯質譜測定乳制品中麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素和乙基香蘭素含量的方法，前處理采用水-叔丁基甲醚提取，氫氧化鈉溶液反萃實現富集和凈化后調酸分析。此方法前處理成本低，快速高效，凈化效果好，儀器分析時間短，靈敏度高，四種化合物在各種乳制品中呈弱基質抑制效應，無需采用基質曲線或者內標校正補償其基質效應。結果表明該檢測分析方法穩定、可靠、易于推廣，可應用于不同乳制品中四種香料化合物的檢測，有望為相關檢測標準的建立提供依據。