阿魏酸鈉對神經病理痛大鼠痛覺的改善及對p38MAPK信號通路的影響*

張愛霞 盧晶 吳饒平

(江西衛生職業學院基礎學科部，江西 南昌，330052)

神經病理痛是指中樞神經或外周神經系統病變引起的疼痛綜合征，以物理性的機械損傷、代謝或營養障礙、病毒感染、神經遞質功能障礙為常見病因，主要表現為自發性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏，是慢性疼痛的常見類型[1-3]。神經病理痛的發病機尚未明確，臨床防治措施有限，明確其發生機制、探索有效的治療方法是鎮痛相關研究的熱點。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，MAPK)是MAPKs家族成員，參與細胞的生長、發育、細胞間功能同步等多種生理過程，與炎癥、應激反應的調控密切相關[4-5]。研究顯示，在神經病理性大鼠脊髓中有p38MAPK表達和活性增高的情況[6]。阿魏酸鈉是中藥中的有效單體成分，具有鎮痛、抗炎、清除自由基、增強免疫等作用，在神經變性、心血管等疾病中有廣泛應用[7-8]。研究證實，阿魏酸鈉對大鼠炎癥性疼痛及小鼠化學疼痛均有較好的鎮痛作用，但其在神經病理痛中的作用機制仍需進一步明確[9]。本研究通過分析阿魏酸鈉對神經病理痛大鼠痛覺改善作用及對p38MAPK信號通路的影響，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級健康SD雄性大鼠40只，8周齡，體質量220～240 g，購于南通大學實驗動物中心[SCXK(蘇)2014-0001]。本研究經實驗動物管理與使用委員會(institutional animal care and use committee，IACUC)審核批準(IACUC-20190105-01)，實驗動物使用按照3R原則給予人道的關懷。

1.2 試劑及儀器 阿魏酸鈉(大連美侖生物公司，純度≥99%)，p38MAPK抑制劑SB203580(上海愛必信生物科技有限公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒(上海遠慕生物科技有限公司)、ECL顯影液(美國Thermo公司)，SP免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)，5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)ELISA試劑盒(合肥萊爾生物科技有限公司)，兔抗鼠p38MAKP、cAMP應答元件結合蛋白(cAMP response element binding，CREB)、磷酸化(phosphorylation，p)-p38MAKP、p-CREB單抗及HRP標記的二抗(美國Abcam公司)，BME-410C型全自動熱痛刺激儀(中國醫學科學院生物研究所)，BW-VonFrey機械刺痛測試包(上海軟隆科技發展有限公司)，Elx 800酶標儀(美國Bio-Tek公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立及分組干預 40只SD雄性大鼠適應性飼養1周，根據體質量以隨機數字表法分為假手術組、模型組、p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組，每組10只。坐骨神經結扎損傷(chronic constriction injury，CCI)模型建立[10]：4組大鼠以硫噴妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，無菌條件下切開大鼠左后肢大腿后外側皮膚，鈍性分離坐骨神經，以4-0絲線結扎坐骨神經4道，每個結扎線間隔1 mm，結扎過程中可見肢體輕微抽動，注意避免結扎過緊阻斷神經外周血流，假手術組暴露坐骨神經后不予以結扎處理，完畢后逐層縫合，以疼痛行為學檢測中機械性縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)、熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)較術前縮短為建模成功；排除術后后肢癱瘓、死亡鼠，模型組1只術后術肢癱瘓剔除。術后每組大鼠肌肉注射青霉素8×104U預防感染，復蘇后單籠喂養。p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組術后當天分別以p38MAPK抑制劑SB203580 1 mg/kg、阿魏酸鈉50 mg/kg，按2 mL/kg體質量腹腔注射，1次/d，連續7 d，假手術組和手術組則予以注射等量生理鹽水。

1.3.2 機械誘發痛檢測 分別于建模前1 天及建模后1、3、7 天固定時間段使用BW-VonFrey機械刺痛測試包檢測大鼠左后肢MWT。將大鼠置于底部有金屬網的有機玻璃箱中，適應15 min后，以VonFrey絲刺激左后肢足底5 s，刺激強度以觸絲彎曲為準，按照up-down法，選擇8根VonFrey絲，折力分別為0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g，以引起抬足或舔足反射的最小刺激折力為MWT，首先以0.6 g力度刺激，若該力度不足以引起抬足或舔足行為則逐級加大力度，測定3次取平均值。

1.3.3 熱刺激誘發痛檢測 機械誘發痛閾檢測后應用BME-410A熱輻射疼痛刺激儀檢測各組大鼠左后肢TWL，有機玻璃箱置于3 mm厚度的玻璃板上，以BME-410C型全自動熱痛刺激儀照射大鼠足底，調節刺激光源強度為55℃，開始照射至大鼠抬腿回避時間為TWL，設置自動切斷時間為25 s避免組織灼傷，測定3次取平均值。

1.3.4 組織取材及大鼠脊髓背角5-HT、GABA濃度檢測 建模后第7天疼痛行為學檢測后處死大鼠，在冰臺上快速取脊背左側L4～6脊脊髓背角組織，保存于-80℃冰箱中備用。ELISA法檢測脊髓背角5-HT、GABA濃度濃度：取低溫保存的大鼠脊髓背角組織0.1 g，置于研缽中，分3次加液氮反復研磨成粉末，加入PBS緩沖液1 mL，充分勻漿，取上層清液，按照ELISA試劑盒步驟操作，使用酶標儀于450 mm波長處檢測光密度值，計算5-HT、GABA濃度。

1.3.5 p38MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白相對表達量檢測 Western blot檢測p38MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白相對表達量：取低溫保存的脊髓背角組織，提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，10%SDS-PAGE電泳，電轉儀轉膜3 h，加入脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBS洗滌后加入一抗(1∶800稀釋)，搖床4℃孵育過夜，含吐溫的TBS洗滌，加入二抗(1∶1 000稀釋)，常溫孵育2 h，化學發光顯色，暗室中曝光，使用凝膠成像系統拍照，Image J軟件分析灰度值，以p38MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白與內參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 大鼠不同時間MWT比較 建模后1、3、7 d與假手術組比較，p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組、模型組的MWT下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組比較，模型組建模后1、3、7 d的MWT下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與建模前1 d比較，p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組、模型組建模后1、3、7 d的MWT下降，差異有統計學意義(P<0.05)；假手術組的MWT建模前后隨時間的延長無明顯變化(P>0.05)，p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組的MWT建模后隨時間的延長無明顯變化(P>0.05)，模型組的MWT隨時間的延長而下降(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同時間點MWT變化

2.2 大鼠不同時間TWL比較 建模后1、3、7 d與假手術組比較，p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組、模型組的TWL縮短，差異有統計學意義(P<0.05)；與p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組比較，模型組建模后1、3、7 d的TWL縮短，差異有統計學意義(P<0.05)；與建模前1 d比較，p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組、模型組建模后1、3、7 d的TWL縮短，差異有統計學意義(P<0.05)；假手術組的TWL建模前后隨時間的延長無明顯變化(P>0.05)，p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組的TWL建模后隨時間的延長無明顯變化(P>0.05)，模型組的MWT隨時間的延長而縮短(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同時間點TWL變化

2.3 大鼠脊髓背角5-HT、GABA濃度比較 大鼠脊髓背角組間5-HT、GABA濃度比較，差異有統計學意義(P<0.001)；與假手術組比較，p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組、模型組的5-HT、GABA濃度更低，差異有統計學意義(P<0.05)；與p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組比較，模型組的5-HT、GABA濃度更低，差異有統計學意義(P<0.05)；p38MAPK抑制組與阿魏酸鈉組5-HT、GABA濃度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 大鼠脊髓背角5-HT、GABA濃度比較

2.4 大鼠脊髓背角p38MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白表達情況比較 大鼠脊髓背角組間p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB比較，差異有統計學意義(P<0.001)；與假手術組比較，p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組、模型組的p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB更高，差異有統計學意義(P<0.05)；與p38MAPK抑制組、阿魏酸鈉組比較，模型組的p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB更高，差異有統計學意義(P<0.05)；p38MAPK抑制組與阿魏酸鈉組p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2、圖3。

圖3 蛋白免疫印記圖

表2 大鼠脊髓背角p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB比較

3 討論

疼痛是機體受到刺激時出現的傷害性感覺，涉及復雜的生理心理機制，可分為傷害性和神經病理性[11-12]。傷害性疼痛多在傷害性刺激消失后隨之消失或緩解，而神經病理痛多為慢性頑固性疼痛，如神經受壓、糖尿病神經痛、帶狀皰疹后神經痛、腰腿痛等有神經系統參與的慢性疼痛，具有遷延、反復發作的特點[13-14]。目前化學藥物是治療疼痛的主要手段，阿片類藥物、水楊酸類、非甾體類等鎮痛藥物存在依賴性、呼吸抑制、胃腸道刺激等缺陷。隨著現代中醫學的發展，止痛類中藥草因毒副作用小、止痛效果好等優勢獲得認可。阿魏酸鈉為桂皮酸衍生物，在當歸、川芎、酸棗仁、桃仁等活血止痛類中草藥中的有效成分，其鎮痛作用被證實，但關于對神經病理痛的相關研究較少。本研究通過建立神經病理痛大鼠模型，并以阿魏酸鈉干預，探討阿魏酸鈉對神經病理痛的痛覺改善作用及機制，以期為神經病理痛的治療及藥物研發提供參考。

阿魏酸鈉作為血止痛類中草藥中的有效成分，在血管性疾病及疼痛類疾病治療中有廣泛應用，能抑制血小板的聚集和血管平滑肌痙攣，改善微循環，并有抗炎、免疫調節、解痙、止痛和增強免疫等作用[15]。研究顯示，阿魏酸鈉能改善糖尿病周圍神經病變，并可抑心肌細胞的重塑[16]。脊髓背角是疼痛信息傳遞和整合的初級中樞，此部位神經元的敏感化可直接易化疼痛信號傳遞至大腦，產生痛覺敏化[17]。5-HT是參與機體痛覺下行通路鎮靜機制中的主要神經活性物質[18]。GABA是脊髓中間神經元突觸釋放的抑制性神經遞質，神經細胞結構功能的改變和重塑可導致GABA的釋放減少，削弱對傷害性信息的抑制作用，產生疼痛[19]。在內源性痛覺下行調控系統中GABA通過5-HT能下行投射纖維在脊髓中發揮鎮痛作用[20]。本研究中阿魏酸鈉組建模后的MWT低于假手術組而高于模型組，TWL短于假手術組而長于模型組，提示阿魏酸鈉能減輕減輕CCI模型大鼠機械超敏和熱痛過敏；且阿魏酸鈉組脊髓背角5-HT、GABA的含量低于假手術組而高于模型組，證實阿魏酸鈉能提高脊髓背角5-HT、GABA的含量，增加對傷害性感覺系統的抑制作用，參與中樞神經的鎮痛。

p38MAPK信號通路是細胞內外信息交流的重要通路，參與細胞的生長、分裂、死亡等多種生物學功能，可在傷害性刺激、生長因子及炎癥介質等因素影響下被激活，參與多種神經病理痛的形成[21-22]。研究顯示，p38MAPK可在慢性神經病理痛狀態下被激活，參與慢性神經病理痛的產生和維持[23]。磷酸化的p38MAPK能作用于下游磷脂酶A2和過氧化酶2生成前列腺素物質，發生痛覺過敏。CREB屬于核內轉錄因子，是細胞內激酶的底物，可由活化的p38MAPK激活，啟動靶蛋白的基因轉錄，促進自發性疼痛、痛覺過敏、痛覺超敏的產生[24]。朱春燕等研究證實，活化的P38MAPK信號通路參與大鼠骨癌痛痛覺過敏的發生[25]。另有研究顯示，阿魏酸鈉可通過抑制p38MAPK信號通路的活化，下調炎癥級聯反應[26]。本研究結果中，p38MAPK抑制組建模后的MWT及脊髓背角5-HT、GABA濃度均低于假手術組而高于模型組，TWL短于假手術組而長于模型組，說明p38MAPK信號通路參與神經病理痛的發生；此外阿魏酸鈉組及p38MAPK抑制組p-p38MAPK/p38MAPK、p-CREB/CREB均高于假手術組而低于模型組，而阿魏酸鈉組與p38MAPK抑制組比較無統計學差異，說明阿魏酸鈉可能通過抑制p38MAPK信號通路的活化，改善神經病理痛。

4 結論

阿魏酸鈉能改善神經病理痛大鼠的痛閾，提高脊髓背角5-HT、GABA的含量，其機制可能與抑制p38MAPK信號通路的活化有關，可考慮將阿魏酸鈉作為神經病理痛治療藥物進行研發。關于阿魏酸鈉是否可通過其他信號通路對神經病理痛產生影響，仍需進一步深入研究。