環境中重金屬暴露對抗生素抗性基因演變影響研究進展

邱文婕， 秦艷， 高品

東華大學環境科學與工程學院

抗生素是一類廣譜殺菌藥物，可預防細菌感染疾病，被廣泛用于治療人體疾病和促進動植物生長[1]。由于缺乏正確而科學的抗生素使用規范，大量抗生素藥物及其代謝產物被排入環境中，對細菌產生選擇性壓力[2]，使敏感性細菌逐漸對其產生抵抗性，進而促進抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的演變和傳播[3-4]。傳統觀點認為，細菌抗藥性會隨著抗生素脅迫作用的消失而消失[5-8]。然而事實并非如此，即使在不使用抗生素的情況下，ARGs仍可穩定存在。越來越多的研究發現，重金屬[9-10]、殺菌劑[11]、消毒劑及其消毒副產物[12-13]、農藥[14]、去污劑[15]、離子液體[16]、納米顆粒[17]等對ARGs的環境行為同樣具有顯著影響。此外，微塑料和大氣顆粒物等固相介質吸附攜帶的無機和有機污染物也會對ARGs產生重要影響[18-22]。由此可見，ARGs在環境中的存在、演變和散播是一個受多因素影響的復雜過程，近年來在全球范圍內已受到廣泛關注。

作為環境中常見的污染物之一，重金屬具有不可生物降解性，能夠在環境中穩定存在，對生物體具有持久性脅迫作用，可通過食物鏈傳遞進行富集，對人體健康產生嚴重危害。重金屬可直接作用于微生物細胞結構，也可通過改變環境條件(如pH等)間接影響細菌，進而產生毒性效應[23-25]。重金屬長期選擇性作用能夠激發細菌的自我防御機制，使其逐漸產生抵抗性[26]。有研究報道[27-29]，從重金屬Cu污染土壤中分離出來的細菌對抗生素脅迫的抵抗性要比Cu敏感細菌更強，表明重金屬可能會通過共選擇作用使其對抗生素產生抵抗性。基于此，筆者針對環境中重金屬對ARGs環境行為的影響過程研究現狀，概述了細菌對抗生素和重金屬的協同抗性機制，重點論述了重金屬對ARGs豐度變化和水平轉移過程的作用影響，并對未來發展趨勢進行了展望。

1 細菌對抗生素和重金屬的抗性機制

1.1 抗生素抗性機制

細菌對抗生素的抗性機制主要包括細胞膜滲透性改變、外排泵機制、細胞靶位點改變等(圖1)。其中，生物膜的形成是細菌抵御抗生素作用的主要途徑[30]，其分泌的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)可形成天然屏障，減弱抗生素分子向細菌體內部滲透[31]。外排泵也稱外排蛋白，細菌可通過外排泵機制將抗生素等對細胞有毒害作用的物質排出體外，降低其對細胞的損害[32]。細胞靶位點改變是指抗生素分子與細菌細胞相互作用的靶位酶基因發生突變，降低彼此之間的親和力，導致抗生素作用失效[32]。

圖1 細菌細胞對抗生素脅迫作用的抵抗機制Fig.1 Resistant mechanisms of bacterial cells to stresses of antibiotics

1.2 重金屬抗性機制

重金屬可在生物體內積累，其毒性作用可通過食物鏈傳遞并放大[33-34]。在重金屬脅迫作用下，細菌可通過以下3種方式削弱其毒性影響[35-37]： 1)通過分泌的EPS與重金屬發生絡合作用和離子交換等過程，降低重金屬的生物可利用性。EPS可為細菌提供許多重要功能，如促進細胞膜的結構發育，增強細菌黏附力，以及提供保護性屏障等[38]，生物膜對抗生素的抵抗性主要源于EPS的保護作用，提高細胞對抗生素的耐受性，EPS也可作為運輸屏障抑制細胞質粒或DNA跨膜轉移[39]。2)在細胞內可通過氧化還原等作用使對細胞具有顯著毒性效應的重金屬降低毒性。3)細胞可通過改變細胞膜的滲透性，減少重金屬進入細胞，也可通過外排泵系統將重金屬排出體外[40]，其外排泵機制與抗生素外排泵機制類似，通過轉運蛋白將重金屬離子泵出細菌細胞(圖2)。

圖2 細菌細胞對重金屬脅迫作用的抵抗機制Fig.2 Resistant mechanisms of bacterial cells to stresses of heavy metals

1.3 抗生素與重金屬共抗性機制

協同抗性機制與交叉抗性機制是細菌抵抗重金屬和抗生素作用的主要共抗性機制[40]。協同抗性機制指重金屬抗性基因(metal resistance genes, MGEs)和ARGs同時位于整合子、轉座子、質粒等遺傳元件上[41]，交叉抗性機制是細菌利用同一系統同時對重金屬和抗生素產生抗性。在此條件下，細菌可對多種重金屬和抗生素具有抗性[42]。

Dickinson等[43]通過分析英國西北部某池塘沉積物中重金屬濃度，以及重金屬抗性和抗生素抗性情況發現，細菌對Zn的耐受水平與Zn濃度呈正相關，而耐Zn菌株占比與奧沙西林、頭孢噻肟和甲氧芐啶抗生素抗性水平呈正相關，抗生素抗性與Zn污染密切相關。此外，從歷史數據分析可知，該池塘在使用抗生素之前，其沉積物中已檢出較高豐度的抗生素抗性細菌，表明重金屬污染對細菌的抗生素抗性產生具有重要影響。與單一抗生素或單一重金屬的選擇性作用相比，抗生素與重金屬協同作用對細菌的選擇性作用影響更大[44]。Knapp等[45]檢測分析了荷蘭不同區域土壤中ARGs豐度，結果表明，當抗生素(包括四環素類、大環內脂類和β-內酰胺酶類)和重金屬(包括Cu、Ni和Zn等)同時存在時，土壤中ARGs豐度顯著高于僅抗生素或僅重金屬存在時的土壤，重金屬和抗生素協同作用對ARGs豐度的增殖具有促進作用[46]。與抗生素相比，重金屬具有不可生物降解性，其對細菌的選擇性作用更為持久。Song等[24]研究發現，農田土壤中的Cu(≥365 mg/kg)和Zn(≥264 mg/kg)能夠顯著增強細菌對四環素的抗性，但高濃度四環素(100 mg/kg)卻未有此效果，重金屬對抗生素抗性的選擇性作用更強，這主要是因為重金屬具有長期生物可利用度，而四環素本身會發生微生物轉化和降解，不會在土壤環境中長期穩定存在，因此對土壤微生物的脅迫作用弱于重金屬。

2 重金屬對ARGs環境行為的影響

2.1 重金屬對ARGs豐度的影響

研究表明[47-50]，不同環境介質中重金屬濃度與ARGs豐度具有顯著相關性，重金屬脅迫作用對抗生素抗性微生物具有共選擇效應，造成ARGs豐度可維持在穩定水平[51]。Stepanauskas等[25]研究發現，水中Cd暴露能夠富集氨芐青霉素抗性病原菌Ralstoniamannitolilytica，提高其抗生素抗性率。He等[52]研究表明，魚塘中Cu和Zn濃度與tetO、tetQ和sul3基因豐度顯著相關，Cu和Zn暴露能夠促進ARGs增殖，四環素類和磺胺類ARGs總豐度分別提高約10%和27%。Ding等[44]同樣報道，Cu和Zn暴露對四環素抗性具有協同作用，當Zn或Cu與土霉素同時存在時，培養體系中四環素抗性基因相對豐度分別為僅土霉素暴露時的1.5和1.2倍。Ji等[47]研究發現，飼養場周邊土壤中ARGs豐度與其對應抗生素濃度的相關關系不顯著，但與Cu、Zn和Hg等重金屬濃度顯著相關，重金屬對ARGs豐度具有重要影響。Hu等[53]研究表明，土壤長期(4～5年)Cu污染對ARGs的多樣性和相對豐度均會產生影響，當土壤中Cu濃度為100～200 mg/L時，被檢出的ARGs數量最多，相比之下，潮土中ARGs相對豐度隨著Cu濃度的提高而升高，并在Cu濃度為800 mg/L時達到峰值，這可能與土壤pH影響Cu生物可利用性密切相關。還有研究表明[54]，土壤長期Ni污染暴露會導致ARGs種類和豐度的升高，當Ni濃度為400 mg/L時，潮土中ARGs數量從61～72顯著升至114～121，而紅壤中ARGs數量同樣從45～64升至116～126，這可能是由于Ni生物可利用性和可移動基因元件的影響造成的。同樣地，Zhang等[55]通過對農田土壤中重金屬和ARGs水平檢測分析發現，Zn和Cu濃度對sul1基因相對豐度具有顯著影響。

2.2 重金屬對ARGs水平轉移的影響

重金屬脅迫作用對ARGs的散播和轉移具有重要影響[54]。Wang等[51]研究報道，水中典型重金屬Cu能夠促進RP4質粒介導的ARGs接合轉移，當Cu2+濃度為0.05～0.5 μg/L時，ARGs接合轉移率隨Cu2+濃度的升高而升高，Cu2+濃度為5.0 μg/L時，ARGs接合轉移率比空白對照提高了16倍，這主要是因為Cu脅迫能夠造成供體細菌細胞損傷，促進ARGs發生轉移。相比之下，當Cd2+濃度為0.05～200 μg/L時，RP4質粒介導的ARGs接合轉移率隨Cd2+濃度的升高而降低，這與其刺激細菌細胞分泌EPS有關，EPS的大量生成可阻礙細胞之間相互接觸，抑制ARGs水平轉移。Lu等[56]研究發現，納米銀(AgNPs)和Ag+均可促進RP4質粒介導的ARGs在不同細菌菌屬間發生水平轉移，在AgNPs濃度為0.1 μg/L條件下交配6 h后，RP4質粒從大腸桿菌轉移至惡臭假單胞菌的效率提高了0.8倍。此外，當Ag+濃度為0.01～10 μg/L時，RP4質粒轉移率隨Ag+濃度的升高而升高，當Ag+濃度為10 μg/L時，其轉移率約為空白對照的2.4倍。AgNPs和Ag+暴露能夠誘導產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，造成細菌細胞膜損傷并作出應激響應，從而促進RP4質粒發生水平轉移。細胞膜致密性是功能基因在細菌種屬間水平轉移的天然屏障，因此細胞膜損傷或破裂可促進基因水平轉移的發生，從而導致ARGs的散播[57-59]。

在ARGs水平轉移過程中，全局調控基因korA、korB和trbA主要負責質粒pCM184-Cm的轉移、復制和穩定性，進而調控其轉移過程。Zhang等[60]研究表明，當Cu2+、Ag+、Cr6+和Zn2+暴露濃度分別為0.01、0.01、0.1和0.05 mg/L時，korA、korB和trbA基因表達水平出現不同程度的下調，其中korA基因表達水平下調程度分別達56.8%、33.2%、10.1%和44.3%。類似地，Pu等[61]研究發現，亞抑制濃度的Cd2+暴露可顯著提高RP4質粒的接合轉移率，濃度為1～100 mg/L的Cd2+能夠顯著提高細菌細胞膜滲透性，當Cd2+濃度為100 mg/L時，交配導致形成基因trbBp的表達水平及DNA轉移水平顯著升高，促進質粒接合轉移。

3 展望

目前，關于重金屬對ARGs環境行為的過程影響已有較多研究報道，但大多仍局限于重金屬與ARGs之間的相關性分析，及其對ARGs水平轉移率的影響，而針對其內在影響分子機制等仍尚未明晰，相關研究也較少。因此，未來還應在以下方面開展深入研究。

(1) 深入研究重金屬對質粒介導的ARGs水平轉移過程影響的內在作用分子機制。

(2) 系統研究不同環境介質中抗生素與重金屬對ARGs豐度和水平轉移的協同選擇性效應，為研發有效的ARGs污染控制技術提供理論基礎。