弓形蟲蛋白質翻譯后修飾研究進展

尹德琦，魏子巍，張義偉，桑曉宇，楊 娜，馮 穎，陳 冉，姜 寧

(沈陽農業大學動物科學與醫學學院，沈陽 110866)

弓形蟲是一種專一性的頂復門胞內寄生蟲，被認為是世界上分布最廣泛的人畜共患病之一[1-2]。剛地弓形蟲的生命周期很復雜，主要以兩種感染形式存在：包括快速復制的速殖子和緩慢分裂的緩殖子。盡管弓形蟲通常會導致成年人和免疫力正常的人產生輕度癥狀，但對母體中發育的胎兒和免疫功能低下的人造成嚴重的危害，甚至可能危及生命[3-4]。此外，弓形蟲病能夠引起家畜流產，嚴重影響養殖業的經濟效益。在日常生活中，人和溫血動物通常會因受到包囊或卵囊污染的食物或水而感染。目前，治療弓形蟲的有效藥物僅限于少數代謝抑制劑，包括乙胺嘧啶、磺胺類藥物、螺旋霉素和克林霉素等[5]。這些藥物具有一定的局限性和細胞毒性，因此尋找新的且有效的藥物靶標迫在眉睫。

PTMs通過將共價修飾連接到多肽鏈上，擴展了20種蛋白質氨基酸的化學組成和信息含量，增加了蛋白質的功能性。大多數的PTMs會在多肽鏈合成(翻譯)后進行連接，因此通常稱為“翻譯后修飾”(PTMs)[6]。PTMs是將一些化學基團共價偶聯到蛋白質特定氨基酸上的過程，包括磷酸化、糖基化、泛素化、琥珀?；?、甲基化、乙?；投辊；投u基異丁?；揎椀萚7-9]。PTMs(例如甲基化、乙酰化、SUMO?；顽牾；?及它們之間的相互作用能夠參與宿主先天免疫和炎癥的調節過程，為傳染性和免疫性疾病的發病機制以及潛在治療途徑提供理論基礎[10]。迄今為止，大約有461 種不同類型的PTMs 已被Uniprot數據庫所收錄(http://www.uniprot.org/docs/ptmlist)，且在微生物、人、動物和植物等方面均發揮著重要功能[11]。PTMs可以在蛋白質的生命周期中的任何時間發生，并且可以通過改變目標蛋白質活性、定位、蛋白質-蛋白質相互作用以及其他功能等。即使同一種蛋白質僅發生一種類型的修飾，也可能具有多種功能；如果同一蛋白質上的相同PTM發生在不同的氨基酸上，則其功能也將不同；如果相同的蛋白質發生不同的修飾類型，那么其功能和涉及的生物學過程更加復雜。因此，PTMs極大地增加了蛋白質組的多樣性和復雜性。弓形蟲在不同的發育階段表達不同的數量的蛋白質，但僅僅是數量的變化無法滿足其復雜生命過程的需要，需要PTMs的參與。PTMs能夠使蛋白質的功能呈現指數增長，從而在弓形蟲的生命活動中發揮著重要作用。棕櫚?；⒎核鼗?、磷酸化和甲基化等PTMs會調控弓形蟲運動和入侵宿主細胞的過程，特別是磷酸化修飾通過調控蛋白激酶(protein kinase G，PKG)對其入侵和逸出宿主細胞起到信號樞紐的作用[7, 12]。當弓形蟲在細胞外環境中尋找宿主細胞入侵時，它會暴露于缺乏營養和氧化應激的環境中，而PTMs會在這種惡劣的環境中維持寄生蟲的生存能力[7, 13]。此外，弓形蟲可通過乙酰化、磷酸化、糖基化、甲基化、小泛素化和泛素化等修飾對其組蛋白和轉錄因子進行調控，從而調節其轉錄及翻譯的過程[7, 14]。弓形蟲通過PTMs下調免疫反應和重組亞細胞結構來操縱所入侵的宿主細胞，為蟲體生存、復制和入侵創造一個有利的條件[15]?？傊?，弓形蟲體內普遍存在著乙?；?、磷酸化、巴豆酰化、琥珀?；?、二羥基異丁基?；⒎核鼗?、糖基化、丙二?；?PTMs 類型，這些PTMs 參與了蛋白質加工與合成、表觀遺傳調控、毒力、轉錄調控、信號轉導、入侵、運動以及應激響應等各種生物學過程。因此，PTMs可能是弓形蟲的發育過渡、生物學和發病機制的關鍵調節劑。本綜述對弓形蟲的PTMs進行簡要總結，旨在進一步全面解析弓形蟲的生物學特性和發病機制，為尋找新的抗弓形蟲藥物靶標奠定基礎。

1 蛋白質翻譯后修飾的研究進展

1.1 泛素化修飾(ubiquitination)

泛素是一種由76個氨基酸組成的多肽，與蛋白質的賴氨酸殘基結合來調控細胞生物學過程。De Monerri等[13]在弓形蟲中共鑒定到超過500多種蛋白質上的1 000個泛素化修飾位點，且大部分的泛素化蛋白與細胞周期調節相關。泛素化修飾需要 E1 泛素激活酶、E2 泛素結合酶和 E3 泛素連接酶的共同調控[16-17]。泛素化修飾在弓形蟲細胞骨架、內膜復合物以及滑動體(gliding-associated protein, GAP)等相關蛋白質上也被檢測到，可能對于細胞骨架的重排具有重要的作用[13]。在弓形蟲染色質修飾酶上檢測到泛素化修飾，包括乙酰基轉移酶GCN5b(轉錄的主調節劑)以及與GCN5b相互作用的蛋白質[18]。此外，在弓形蟲組蛋白以及AP2轉錄調節因子中也發現多個泛素化位點，可能對弓形蟲的轉錄具有重要的調控作用[13]。弓形蟲35%的泛素化蛋白是與細胞周期調控相關的，且與磷酸化修飾之間有著重要的相互作用。

1.2 小泛素化修飾(SUMOylation)

小泛素化修飾是小泛素相關修飾物與賴氨酸殘基的共價連接過程。弓形蟲的蛋白質組中約有1%蛋白質發生SUMO修飾，并參與轉錄、DNA復制和修復、染色體分離和信號轉導等細胞功能[19]。該修飾由3種酶進行調控: E1-SAE1/SAE2異二聚體(活化酶)、E2/Ubc9(結合酶)和E3酶(連接酶)[19]。雖然大多數SUMO修飾調控酶都在細胞核中，但SUMO修飾的發生并不局限于細胞核。研究表明，SUMO修飾在細胞質、質膜、線粒體和內質網中均發揮重要的作用[19-20]。與靶向蛋白質降解的泛素化修飾不同，SUMO修飾可以保護蛋白質不被降解，也可將蛋白質引導到細胞中的特定位置，尤其是細胞核[20-21]。HSP70和HSP90等熱休克蛋白質均被檢測到發生SUMO修飾，有助于弓形蟲的抗應激反應，同時SUMO修飾在弓形蟲入侵宿主細胞、包囊發育/維持和發病機制中起著關鍵作用[19]。盡管泛素化和SUMO修飾非常相似，但它們具有不可替代的生物學功能。

1.3 棕櫚?；揎?palmitoylation)

S-棕櫚?；亲貦八狨?一種飽和16碳脂肪酸)通過硫酯鍵與半胱氨酸殘基共價連接發生[22-23]。在弓形蟲中共鑒定到282種棕櫚?；鞍踪|，主要位于細胞質和細胞膜上。棕櫚酰化通常參與調節蛋白質膜定位、改變蛋白質穩定性、蛋白質/蛋白質相互作用和蛋白質轉運等[24]。與其他脂質類修飾不同，棕櫚?；哂锌赡嫘院蛣討B性。棕櫚?；揎椨勺貦磅；D移酶(palmitoyl acyl transferases, PATs)催化，弓形蟲基因組編碼18個潛在PATs，其中16個在速殖子中表達[24-25]。因此，棕櫚?；赡茉诠蜗x速殖子階段發揮重要作用。Foe等[26]證實了肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC1)、肌球蛋白質MyoA以及GAP45、GAP40、GAP50和GAP70等滑動體相關蛋白質均發生棕櫚?；揎?，這些發現揭示滑動體是速殖子的一種被高度棕櫚?；膹秃衔?。進一步的研究表明，阻斷頂端膜抗原(apical membrane antigen 1, AMA1)棕櫚?；稍黾覣MA1及微線體相關蛋白質(microneme proteins，MICs)從頂端復合體的釋放，表明棕櫚?；揎椩诠蜗x速殖子的入侵階段扮演著關鍵的角色。

1.4 磷酸化修飾(phosphorylation)

1.5 O-糖基化修飾(O-GlcNAcylation)、C-甘露糖基化修飾(C-Mannosylation)和O-巖藻糖基化(O-fucosylation)

糖基化修飾主要分為N-糖基化和O-糖基化，對弓形蟲的研究主要集中在后者。O-糖基化修飾(O-GlcNAcylation)是由ON和OFF酶(O-GlcNAc轉移酶和O-GlcNAcase)調節的高度動態的PTM，可以與磷酸化競爭，但其功能尚不清楚[29]。O-糖基化的功能是多種多樣的，包括調控信號傳導過程，并影響蛋白質表達、降解和運輸等[29-30]。此外，黏蛋白樣糖蛋白的黏蛋白結構域上糖基化的缺失會導致弓形蟲囊壁結構剛性的缺失，這說明糖基化修飾可能參與調節弓形蟲細胞壁的相關結構[31]。

C-甘露糖基化是后生動物中存在的血小板反應蛋白1型重復序列的常見修飾類型，最近在頂復門寄生蟲中也被發現[32-34]。這種糖基化是由DPY19家族的酶介導，該酶將α-甘露糖轉移至序列WX2WX2C中色氨酸殘基[34]。C-甘露糖基轉移酶活性與寄生蟲對宿主細胞的黏附力、運動能力、入侵和逸出宿主細胞等有關[32, 34]。雖然C-甘露糖基化轉移酶DPY19不是弓形蟲存活所必需的，但對黏附、運動和毒力卻很重要[35]。由于糖基化修飾的調控機制尚不十分清楚，因此仍然需要徹底研究其對弓形蟲生命周期和致病潛力的影響。

弓形蟲O-糖基化轉移酶(OGT)可修飾數千種細胞內蛋白質，調控O-巖藻糖基化修飾參與轉錄，mRNA加工和信號轉導等過程[36]。近期的研究發現，O-糖基化轉移酶是介導O-巖藻糖基化所必需的，且O-巖藻糖基轉移酶“Spindly”會影響弓形蟲的蛋白表達和毒力[36]。盡管O-巖藻糖基化修飾的許多內源蛋白質對于速殖子的抗應激能力很重要，但O-巖藻糖基化修飾酶“Spindly”蛋白質的敲除試驗證明，它并不是介導弓形蟲O-巖藻糖基化所必需的。因此，O-巖藻糖基化很可能為弓形蟲提供了一種預防機制，可以生成和儲備一些關鍵蛋白質，以加強蟲體對外界環境的適應力。

1.6 乙?；揎?acetylation)

組蛋白乙?；巧婕肮蜗x生長和發育的關鍵PTM類型，使用液相-串聯質譜(LC-MS/MS)成功地在弓形蟲中鑒定到400多個新的乙?；稽c，包括與新陳代謝、翻譯、折疊和細胞骨架等相關蛋白質[37]。活躍增殖的速殖子中富含豐富的賴氨酸乙?；?，這可能與急性弓形蟲病的發病機制相關。AP2轉錄因子可能通過乙酰化修飾來調節弓形蟲的基因轉錄[38]。賴氨酸乙酰轉移酶(如MYST-A、MYST-B、GCN5-A和GCN5-B等)以及賴氨酸去乙酰修飾酶HDACs家族蛋白質等，對乙?；揎椌哂兄匾恼{控作用[39-41]。此外，基于賴氨酸脫乙酰基酶(HDACs)抑制劑(如FR235222)的抗寄生蟲作用，乙酰化修飾調控酶可作為潛在的有效藥物靶標[42]。蛋白質乙?；揎椝脚c寄生蟲基因型特異性毒力之間具有重要的關系。在弓形蟲RH株中發生賴氨酸乙酰化蛋白質(458個)最多，其次是PYS株(188個)，而在PRU株中僅檢測到115個乙酰化蛋白[43]。總之，賴氨酸乙?；诠蜗x的多種生物學過程中均發揮重要的功能，對其存活和發育至關重要。

1.7 精氨酸甲基化修飾(methylation)

精氨酸甲基化涉及多種生物學過程，主要發生在細胞質和核蛋白上，與表觀遺傳和轉錄調節、RNA剪接和DNA損傷反應等過程相關[44]。精氨酸單甲基化(monomethyl arginine, MMA)修飾大約占弓形蟲蛋白質組的5%，主要包括DNA和RNA結合蛋白質等[12]。剛地弓形蟲的精氨酸單甲基化修飾包含大量的RNA結合蛋白和ApiAP2轉錄因子，這表明精氨酸甲基化修飾可能在蟲體的RNA生物學和轉錄調控中發揮作用。在之前的磷酸蛋白質組學研究中，精氨酸單甲基化的蛋白質中有90%被檢測也發生磷酸化修飾，這增加了弓形蟲中MMA與磷酸化之間相互作用的可能性[12]。精氨酸甲基化由甲基轉移酶和去甲基轉移酶共同調控，弓形蟲基因組含有五種假定的精氨酸甲基轉移酶(protein arginine methyltransferases, PRMTs)，其中PRMT1對細胞分裂和生長起著關鍵作用[12, 45]?？傊琈MA是細胞核活性的重要調節劑，且PRMT1是弓形蟲中MMA的主要調節劑。

1.8 琥珀?；揎?succinylation)

與賴氨酸甲基化和乙酰化相比，賴氨酸琥珀?；徽J為能促進蛋白質化學性質發生更實質性的轉化，因為琥珀酰化可以轉運更大的結構部分[46]。在生理pH條件下，賴氨酸殘基上發生的琥珀?；烧T導電荷的改變，從而有利于調節底物蛋白質的結構和功能[47]。由于賴氨酸琥珀?；鸬慕Y構變化更為明顯，可能會促進蛋白質功能發生更為顯著的變化。研究發現弓形蟲中147個蛋白質上含有425個獨特的賴氨酸琥珀?；稽c，且參與代謝、表觀遺傳、基因調控等生物學功能[46]。此外，研究發現多個琥珀酰化修飾蛋白質[如丙酮酸脫氫酶復合物亞基(PDH-E3II)、檸檬酸合酶I(CS1)、烏頭酸水合酶(ACN)、異檸檬酸脫氫酶(IDH、二氫脂酰胺S-琥珀?；D移酶(DLST)、琥珀酰CoA連接酶亞基β(SUCL2)、琥珀酸脫氫酶(SDHA)、富馬酸水合酶(FH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)]定位于弓形蟲線粒體或頂質體，這對三羧酸循環、脂肪酸和類異戊二烯合成等均具有重要作用[48]。弓形蟲賴氨酸琥珀酰化涉及多種細胞功能，特別是與能量代謝過程有關。

1.9 N-肉豆蔻酰化修飾(N-myristoylation)

在弓形蟲中有157種蛋白質會發生N-肉豆蔻?；揎?，且對其生命周期的調控至關重要[49]。N-肉豆蔻酰基轉移酶(N-myristoyltransferase，NMT)是寄生蟲中必不可少的肉豆蔻?；?。弓形蟲蛋白質TGME49_209160(myristoyl CoA: protein N-myristoyltransferase)是一種N-肉豆蔻?；D移酶，這可能是新的潛在的抗寄生蟲藥物靶標[49]。此外，多個肉豆蔻?；揎椀鞍踪|對弓形蟲運動、入侵和逸出細胞等過程具有重要的調控作用，如滑動體相關蛋白質GAP45/70，鈣依賴性激酶CDPK1和CDPK3等[49]。盡管N-肉豆蔻?；揎椀耐枯^低，但是仍然扮演著不可或缺的角色。

1.10 巴豆?；揎?crotonylation)

巴豆?；揎椩诩毎⑽⑸?、植物等中均被報道過具有重要的功能[50-51]。通過非標定量技術(label free)和液相-質譜聯用的研究策略，在弓形蟲RH株中共鑒定到有1 061個巴豆?；揎椀鞍踪|(3 735個位點)以及在ME49株中共鑒定到有984個巴豆?；揎椀鞍踪|(3 396個位點)[8, 52]。生物信息學分析表明巴豆?；揎椀鞍踪|參與調控核糖體、糖酵解/糖異生、三羧酸循環、碳代謝、RNA轉運、氧化磷酸化、氨酰tRNA生物合成和蛋白酶體等多種代謝通路，對弓形蟲的生長發育具有不可或缺的作用。其中弓形蟲RH株與ME49株在多個重要的代謝調控酶，如磷酸甘油酸激酶、醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、檸檬酸合酶I、烏頭水合酶等均存在巴豆酰化修飾水平差異，對弓形蟲不同毒力株的能量代謝過程可能具有重要的差異性調控作用。

1.11 二羥基異丁?；揎?2-hydroxyisobutylation)

賴氨酸2-羥基異丁?；且环N新發現的蛋白質翻譯后修飾類型[53]。通過Label free技術在弓形蟲RH株中共鑒定到有1 950個二羥基異丁基酰化修飾蛋白質(9 502個位點)，并在ME49株中共鑒定到1 720個二羥基異丁基?；揎椀鞍踪|(8 092個位點)[8, 52]。KEGG富集分析表明二羥基異丁?；揎梾⑴c調控核糖體、糖酵解/糖異生、三羧酸循環、碳代謝、氨酰tRNA生物合成、蛋白酶體、剪切體和氨基酸的生物合成等多種生物學過程[8，54]。二羥基異丁?；揎棇蜗x肌動蛋白、肌球蛋白、微線體蛋白質、棒狀體蛋白質以及致密顆粒等均有重要的調控作用。與弓形蟲ME49株相比，二羥基異丁?；揎椏赡軐蜗xRH株的修飾程度更高，特別是對其運動、毒力以及入侵宿主細胞的過程有著更重要的調控作用[8]。此外，相對于其他修飾，二羥基異丁?；揎椀耐枯^高(僅低于磷酸化修飾)，對弓形蟲的生長發育具有重要的調控作用。

1.12 丙二酰化修飾(malonylation)

賴氨酸丙二?；状问窃诓溉閯游锛毎图毦毎斜话l現的，它與脂肪酸合成、氧化和糖酵解過程有關[55-56]。在弓形蟲中共鑒定到300多個丙二?；揎椀鞍踪|位于不同的亞細胞區室，并在糖酵解/糖異生、氨酰基-tRNA生物合成、磷酸戊糖途徑和脂肪酸生物合成等代謝過程中均發揮重要的作用[57]。其中糖酵解過程重要的調控酶乳酸脫氫酶(LDH1)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)均發生丙二?；揎?，可能對弓形蟲能量代謝具有重要的調節作用。

2 蛋白質翻譯后修飾之間的相互作用

蛋白質翻譯后修飾相互作用發生在多種PTMs之間，其目的是共同調節弓形蟲多種生物學過程。弓形蟲具有一種稱為滑動體的獨特機制，主要由在質膜下的肌動球蛋白組成[58]。蟲體可以依賴于該機制進行滑動運動，以及進入宿主細胞和從感染細胞中逸出等。弓形蟲滑動體作為多個PTMs的主要靶標，受多種修飾共同調節其滑動運動。如在弓形蟲中TgGAP45是一種滑動體的核心成分，它能夠發生泛素化、肉豆蔻?；⒆貦磅；?、二羥基異丁酰化和磷酸化修飾，在滑行運動、入侵和逸出過程中發揮作用[8, 13,59-60]。因此，PTMs的之間的相互作用對弓形蟲滑動體有重要的調節作用。研究表明21%泛素化蛋白質也被乙?；?，同時泛素化和乙酰化之間的相互作用可以抑制泛素化修飾從而調節蛋白質的穩定性[61]。此外，磷酸化通常是泛素介導的降解的前提條件，且與甲基化修飾之間也存在相互作用[19, 62]。因此，不同PTMs之間可能具有相互協同或相互拮抗的作用，從而有序的調控弓形蟲的生物學過程。

基因表達是一個受多種因素調控的復雜過程。組蛋白是染色體中核小體基本結構的重要組成部分，作者繪制了到目前為止已在弓形蟲組蛋白上鑒定出的所有PTMs修飾圖譜(圖1)，包括磷酸化、乙?；?、甲基化、磷酸化、巴豆?；?、二羥基異丁?；㈢牾；?、泛素化、糖基化等[8, 13-14, 19, 28, 38, 45]。與組蛋白H2Ba、H2Ax、H2Bb和H3相比，弓形蟲組蛋白H4、H3、H2Ba、H2Bv、H2Az具有更顯著的PTMs豐富度。此外，大部分組蛋白修飾位點均有多種修飾調控，其中H4K32、H4K68、H3K24、H3K28、H3K57、H2BaK71、H2BaK100、H2BaK112、H2AzK10和H2AzK18具有4種以上的PTMs，這可能是表觀遺傳調控的重要修飾位點。因此，弓形蟲組蛋白核心上的PTMs可能是寄生蟲生長和分化的關鍵元件，其生物功能調節不是由單一類型的修飾完成的，而是由多種修飾的共同調節。目前，關于弓形蟲不同類型的PTMs之間的相互作用機制，人們仍然知之甚少，需要進一步研究。

圖1 弓形蟲組蛋白PTMs修飾位點匯總(彩圖見OSID資料)

3 討論與展望

PTMs是指蛋白質翻譯后的動態可逆的化學修飾，在蛋白質加工和成熟過程中起著重要作用，能夠改變其理化性質，影響蛋白質的空間構象和穩定性[63-65]。PTMs在弓形蟲生物學的多方面都發揮重要作用(表1)，包括分化、運動、入侵、逸出、能量代謝、信號、傳導、應激反應、基因轉錄和表達、細胞周期調節、蛋白質相互作用和定位等[8,12-13,15,19,26,28,34,38,46,59,66-67]。

表1 弓形蟲蛋白質翻譯后修飾匯總

隨著高通量蛋白質組學技術的進步，PTMs已經在許多不同生物中逐漸被解析[68-70]。在但鑒定生物樣品中的PTMs時仍然面臨許多挑戰，如鑒定到的數據仍然存在較高錯誤發現率(false discovery rate, FDR)、樣品數據污染以及技術方法等問題[71-72]。此外，傳統的質譜技術在PTMs的研究中還存在靈敏度不夠等局限性；大多數的PTMs在樣本中通量低(包含低豐度蛋白質)且具有時空動態等復雜性；一些同分異構肽段通過質譜無法進行準確有效分離等一系列問題都會影響組學數據分析的準確性。因此在評估數據時，必須盡可能考慮所有影響結果準確性的因素，如數據庫的選擇、抗體質量、蛋白質提取效率、樣品純度、用于搜索數據庫的算法、PTM富集方法等。近期的研究表明，4D蛋白質組學即在保留時間(retention time)、質荷比(m/z)、離子強度(intensity)的基礎之上增加了第四個維度——離子淌度(mobility)[73]，使鑒定到的蛋白質覆蓋度、檢測周期、數據準確性等方面得到全面提升。未來隨著更多新技術的出現，人們期待能夠發現更多的PTMs類型，從而能勾畫一個全面且動態的宿主細胞與弓形蟲的修飾網絡譜圖，為更好地解析蟲體與宿主相互作用奠定基礎。同時希望能夠對弓形蟲不同發育階段(緩殖子、速殖子和卵囊)之間以及弓形蟲不同表型之間的PTMs進行動態且完整的圖譜分析，這將有助于闡明弓形蟲表型轉化和毒力變化的潛在機制。

PTMs是目前研究最為重要的前沿領域之一，在弓形蟲的生命活動中發揮著重要的作用。PTMs需要一系列調控酶來實現正負可逆調節，如PATs、MYST-A、MYST-B、PRMTs、GCN5-A、GCN5-B、HDACs等都可能是研制抗弓形蟲藥物的重要靶標[41, 74]。目前大多數弓形蟲PTMs研究主要還集中在生物信息學分析層面，未來的研究應進一步解析PTMs的生物學功能和利用CRISPR-Cas9基因編輯技術等對重要修飾蛋白質進行功能驗證，以揭示PTMs在剛地弓形蟲中的確切作用。此外，現階段對于弓形蟲的組學研究相對比較單一，下一步應該運用多組學的聯合分析的方法(如蛋白質組學、修飾組學、代謝組學和轉錄組學等)對弓形蟲及其與宿主細胞相互作用開展重要研究，從而更全面的揭示其生物學特征，以期為研制新型抗蟲藥物奠定基礎。