禽致病性大腸桿菌clpV2基因缺失株的構建及生物學特性分析

鐘昊然，王培莉，郭 佳，王 亨，朱國強，李建基，崔璐瑩，董俊升，孟 霞*

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009；2.教育部農業與農產品安全國際合作聯合實驗室，揚州 225009)

在1/4的革蘭陰性菌中都能發現六型分泌系統(Type VI secretion system, T6SS)的存在[1-2]。ClpV作為T6SS的必需組分，能在ATP的驅動下完成T6SS的回收，為T6SS分泌效應因子提供能量[3]。大腸桿菌(Escherichiacoli，Ecoli)被證實含有3套T6SS，有研究表明T6SS2在侵襲腦微血管內皮細胞的過程中發揮重要作用，且T6SS2也含有核心組分ClpV2[4]。但目前關于ClpV2的生物學特性研究卻鮮有報道[5]。

本研究利用Red同源重組，成功構建了TW-XM菌株T6SS2中的clpV2基因突變株，并比較各突變株部分生物學特性的差異，為深入研究ClpV2在APEC致病性的過程中發揮何種作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

菌株APEC TW-XM、DH5α；質粒pKD46、pKD3、pCP20均由揚州大學朱國強教授饋贈。

1.2 主要試劑、儀器

Marker Ⅲ購自北京天根生化科技有限公司；Mueller-Hinton瓊脂購自青島高科園海博生物技術有限公司；常用藥敏片購自杭州微生物生物試劑有限公司。

1.3 引物設計與合成

根據APEC TW-XM菌株已知的clpV2基因序列，設計缺失引物ΔclpV2-Cm-F/ΔclpV2-Cm-R、缺失鑒定引物clpV2-F/clpV2-R及回補引物pBR-clpV2-F/pBR-clpV2-R。引物均由南京擎科生物技術公司合成，序列見表1。

表1 構建clpV2基因突變株的引物序列

1.4 clpV2基因突變株的構建與遺傳穩定性試驗

按照丁雪燕等[6]的方法，通過Red同源重組構建clpV2基因缺失株。篩選clpV2線性片段與含有pKD46的TW-XM感受態細胞的陽性轉化子，以clpV2-F/clpV2-R為引物進行PCR鑒定。隨后將pCP20質粒導入一次重組菌中，再次以clpV2-F/clpV2-R為引物進行PCR鑒定。鑒定正確后命名為TW-XM△clpV2。以pBR-clpV2-F/pBR-clpV2-R為引物，TW-XM為模板，擴增得到clpV2基因。經測序驗證正確后克隆至表達載體pBR322中，將重組質粒pBR322-clpV2轉化至TW-XM△clpV2，得到回補株TW-XMC△clpV2。

將上述得到的突變株連續傳代，取第1、10、20、30代進行遺傳穩定性分析。

1.5 生長曲線及運動性測定

將各菌株菌液按1∶100轉接至30 mL新鮮的LB培養基中，于37 ℃ 180 r·min-1震蕩培養，每小時取100 μL測定培養物的OD630 nm值，繪制生長曲線。將1 μL培養至OD630 nm=1.0的菌液滴加于半固體平皿中心，37 ℃培養18 h后測定細菌運動環直徑。

1.6 生物被膜形成能力測定

采用96孔微孔板法測定生物被膜形成能力。將濃度為OD630 nm=1.0的各菌株菌液，按1∶100接種至96孔板中培養24 h。在蒸餾水洗滌后加入2%結晶紫染色20 min，洗滌后加入95%乙醇，檢測OD630 nm值。

1.7 藥物敏感性試驗

用K-B法藥敏試驗檢測藥物敏感性。將新鮮菌液配成0.5麥氏單位菌液后，在M-H瓊脂表面均勻涂布，將藥敏片貼于瓊脂表面，37 ℃培養18 h，測量抑菌圈直徑大小。

1.8 統計學分析

數據處理采用SPSS 17.0軟件，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結 果

2.1 clpV2基因突變株的構建與遺傳穩定性試驗

如圖1所示：野生菌clpV2擴增片段為2 688 bp，二次重組體為921 bp。回補株顯示有兩個特異性條帶，921 bp處為缺失株的二次重組條帶，2 688 bp處為回補質粒pBR322-clpV2的clpV2片段，表明各突變株構建成功。且連續傳30代后均未發生突變，表明突變株具有良好的遺傳穩定性。

M.Marker Ⅲ相對分子質量標準；1.野生株TW-XM；2～5.缺失株TW-XM△clpV2；6～8.回補株TW-XMC△clpV2

2.2 clpV2基因對生長曲線及藥物敏感性的影響

生長曲線結果顯示，各菌株在生長對數期、平臺期、遲緩期的生長情況均無明顯差異，表明clpV2基因不影響TW-XM的生長；藥敏試驗結果顯示各菌株對上述9種藥物的敏感性無明顯差異(結果未展示)。

2.3 clpV2基因對運動性及生物被膜形成的影響

TW-XM△clpV2的運動環顯著小于野生株(P<0.05)，提示clpV2基因的缺失影響了運動性(圖2)；TW-XM△clpV2的生物被膜形成能力與野生株相比顯著下降，提示clpV2基因的缺失會影響生物被膜形成能力(圖3)。

*.P<0.05；ns.P>0.05

*.P<0.05

3 討 論

2000年，Datsenko和Wanner[7]利用兩步同源重組法對大腸桿菌K-12進行了基因敲除，該方法簡單易行，相比傳統方法重組率也更高[8]。如今，該方法在大腸桿菌的基因敲除中被廣泛應用。

國內外已有關于clpV的報道，Liu等[9]在敲除遲緩愛德華菌(Citrobacterfreundii)中的clpV后發現細菌鞭毛蛋白的表達下調，同時Tang等[10]發現假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)clpV基因的沉默會下調鞭毛合成相關基因的表達，而本試驗利用Red同源重組敲除clpV2基因后細菌運動能力減弱，則證明其與大腸桿菌的運動能力存在關聯。除clpV2基因外，對T6SS2其余核心組分的研究也有了一定進展。Ding等[11]先前已成功敲除APEC CE129中T6SS2的另一核心組分hcp2基因，并對相應突變株進行了生物學特性分析。結果顯示細菌的生物被膜形成能力顯著降低、對雞胚成纖維細胞的黏附能力顯著減弱、Ⅰ型菌毛主要亞單位基因fimA以及fimC的mRNA相對表達量顯著降低。在本研究中，clpV2的缺失也導致生物被膜形成能力減弱，證明T6SS2可能參與調控Ⅰ型菌毛的合成，從而影響生物被膜形成能力和黏附能力，進而影響致病力。但具體哪些黏附素表達受到影響還有待進一步探索。與此同時，clpV2基因的缺失不影響細菌的藥物敏感性，說明T6SS2可能不參與耐藥性調控。

而本試驗中TW-XMclpV2基因的成功敲除，有助于深入了解 T6SS2的功能，同時也為研究APEC TW-XM致腦膜炎的機制奠定基礎。

4 結 論

利用Red同源重組成功構建TW-XM的clpV2基因缺失株，并構建相應的回補株。各突變株均能穩定遺傳，發現clpV2基因的缺失不影響TW-XM菌株的生長速度以及對多種抗生素的敏感性，但會導致其運動能力和生物被膜形成能力顯著下降。