神經介素B及其受體NMBR參與抗A型流感病毒H1N1亞型感染的信號通路

唐夢瑤，馬逸杰，田世茂，萬乾暉，楊桂紅

(福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)閩臺動物病原生物學重點實驗室，福州 350002)

A型流感病毒(influenza A virus, IAV)屬于正黏病毒科流感病毒屬的單股負鏈RNA病毒，其可通過空氣傳播引起多種動物的急性上呼吸道感染和急性肺炎導致動物死亡[1-5]。IAV基因組含8個片段，共編碼18種蛋白[6-8]，這種分節段的形式使得A型流感病毒在傳播過程中易受疫苗免疫或藥物選擇壓力而產生基因重組或氨基酸位點突變，導致原有的疫苗免疫失敗和新的耐藥毒株的產生，使流感疫情防控形勢日趨嚴峻，嚴重威脅著動物的生命和我國養殖業的健康發展[9-13]。相對于流感病毒的高度變異性，宿主的抗病毒因子比較保守，以禽流感病毒-宿主蛋白的相互作用為突破口，通過調控宿主因子的抗病毒作用達到阻止病毒入侵的目的[14-17]，為篩選新型抗流感藥物提供重要思路。

神經介素B(neuromedin B, NMB)是一種含有32個氨基酸的生物活性肽[18-24]，可通過結合其特異性受體參與機體的多種生物學功能[25-30]。本課題組前期研究發現，IAV/H1N1/PR8亞型毒株感染宿主后會誘導NMB和NMBR表達出現顯著上升，并且NMB/NMBR通過調節PR8感染誘導的IL-6和IFN-α表達而抑制PR8在小鼠體內的復制[31]。以上研究結果表明, NMB/NMBR是機體發揮抗IAV/H1N1感染的先天性免疫應答系統的重要組成部分，但關于其抗IAV/H1N1感染的作用機制尚不清楚。因此，本研究從體內和體外水平分別探索了介導NMB抗IAV感染的重要分子細節，以期揭露可能介導NMB發揮抗IAV/H1N1感染的信號途徑，從而為臨床研制新型的抗IAV藥物提供更充足的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

MLE-12傳代細胞(小鼠肺泡上皮細胞)為本實驗室保存；A型流感病毒株：A/PR/8/34(H1N1)和A/WSN/33(H1N1)均為本實驗室保存經典模式毒株；SPF級野生型C57BL/6 J品系小鼠(18 g±2 g)購自上海吳氏實驗動物；NucleoZol RNA提取試劑購自上海基因生物技術國際貿易有限公司；RNA反轉錄cDNA試劑盒(貨號：E047)購自上海近岸科技有限公司；Anti-GAPDH(貨號：HC301-01)購自TransGen biotech公司；Anti-NP 由本實驗室制備并保存；Anti-NMBR(貨號：ab134141)購自Abcam公司；Anti-NMB(貨號：ER60923)購自杭州華安生物技術公司；Anti-IκBα(貨號：sc-1643)購自Santa Cruz Biotechnology公司；Anti-P65(貨號：D14E12)、Anti-p-P65(貨號：93H1)購自Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠、鼠抗兔二抗購自Jackson Immunoresearch公司，NF-κB抑制劑BAY11-7028(貨號：SF0011-10 mM)購自上海碧云天生物技術有限公司; 普通PCR儀、電泳凝膠成像儀購自美國伯樂公司；熒光定量LightCycler 96 PCR儀購自羅氏公司；細胞恒溫培養箱購自日本三洋公司；倒置顯微鏡購自上海尼康儀器有限公司；化學發光儀購自美國ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇 細胞凍存管置于37 ℃水浴鍋內快速解凍，取凍存管中的細胞至15 mL離心管中和2 mL完全培養基混勻，800 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1 mL完全培養基重懸細胞沉淀，轉移到含有7 mL完全培養基的培養皿中輕輕搖勻，置于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中培養。

1.2.2 BAY11-7028處理PR8或WSN感染MLE-12細胞 為研究NMB發揮抗IAV感染的天然免疫反應是否與NF-κB信號通路關聯，分別用10 μL PR8(PFU=6.5×106)或10 μL WSN(PFU=1.3×107)感染MLE-12細胞后，添加1 μL 10 μmol·L-1NF-κB抑制劑BAY11-7028，分析NF-κB信號通路是否影響NMB/NMBR對IAV/H1 N1感染的調節作用。試驗分為4組：①對照組；②對照組+BAY11-7028；③攻毒組；④攻毒組+BAY11-7028，每組重復6個孔。攻毒15 h后收取RNA樣和蛋白樣，通過RT-PCR和qRT-PCR檢測MLE-12細胞中NMB、NMBR、IL-6和IFN-α以及病毒NP基因表達變化，Western blot檢測MLE-12細胞中NMB、NMBR、P65/p-P65、IκBα以及病毒NP蛋白表達水平變化。

1.2.3 NMB和BAY11-7028共處理PR8或WSN感染MLE-12細胞 為探究抑制NF-κB信號通路后是否影響NMB對PR8或WSN感染的MLE-12細胞中IL-6和IFN-α以及病毒NP基因表達的調控，分別用10 μL PR8(PFU=6.5×106)或10 μL WSN(PFU=1.3×107)感染MLE-12細胞后添加外源性1 μL 1 nmol·L-1NMB和1 μL 10 μmol·L-1NF-κB抑制劑BAY11-7028。試驗分為5組：①對照組；②攻毒組；③攻毒+NMB組；④攻毒+BAY11-7028組；⑤攻毒+BAY11-7028+NMB組，每組重復6個孔。攻毒15 h后收取RNA樣，通過qRT-PCR檢測MLE-12細胞中IL-6、IFN-α和病毒NP基因表達變化。

1.2.4 NMB對PR8或WSN感染誘導小鼠體內NF-κB信號通路的影響 為進一步探究NMB對IAV感染小鼠體內NF-κB信號通路的影響，選取6～8周齡(18 g±2 g)SPF級野生型C57小鼠，分別用100 μL PR8(PFU=6.5×106)或100 μL WSN(PFU=1.3×107)滴鼻感染，12 h后腿部肌肉分別注射100 μL 1 nmol·L-1NMB或100 μL 1 nmol·L-1NMBRA。試驗分為6組：①對照組；②對照組+NMB；③對照組+NMB+NMBR拮抗劑(NMBRA)；④攻毒組；⑤攻毒組+NMB；⑥攻毒組+NMB+NMBRA，每組6只小鼠。攻毒96 h后取小鼠肺組織分別稱50 mg提取RNA和蛋白，通過RT-PCR和qRT-PCR檢測IL-6、IFN-α和病毒NP基因表達變化，Western blot分析P65/p-P65、IκBα和病毒NP蛋白表達水平變化。

1.2.5 RT-PCR和qRT-PCR 按照NucleoZol 總RNA提取試劑說明書提取各組樣品總RNA，然后根據RNA反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。使用NCBI數據庫在線引物設計工具Primer-BLAST設計引物，具體引物序列見表1。RT-PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共25～35個循環；72 ℃ 10 min。反應結束后，取PCR擴增產物10 μL 經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析目的條帶。qRT-PCR反應條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共40個循環；72 ℃ 30 s；反應結束后，對數據結果進行統計分析。

表1 RT-PCR 和qPCR引物

1.2.6 Western blot(WB) 提取MLE-12細胞和小鼠肺組織樣品蛋白，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后轉移到硝酸纖維素(NC)膜上；將(NC)膜置于5%牛奶中封閉2 h，1×TBS中漂洗干凈，一抗孵育2～3 h，再用1× TBS中漂洗30 min(每隔10 min換一次TBS)，二抗孵育2 h，再次用1×TBS中漂洗30 min(每隔10 min換1次TBS)，化學發光儀曝光。

1.3 統計學分析

以上相關試驗均進行3次以上獨立重復試驗，運用T檢驗進行統計分析差異顯著性。其中*.P<0.05 表示差異顯著；**.P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 BAY11-7028對PR8或WSN感染MLE-12細胞中相關基因轉錄水平的影響

通過RT-PCR和qRT-PCR檢測各組細胞中NMB、NMBR、IL-6、IFN-α和NP基因轉錄水平的差異。結果顯示，BAY11-7028可誘導PR8感染的MLE-12細胞中NMB、NMBR、IL-6和IFN-α 基因表達水平均有所下降，NP表達水平有所上升(圖1)，其中NMB顯著下降(P<0.05)，NMBR、IL-6和IFN-α極顯著下降(P<0.01)，NP極顯著上升(P<0.01)。

A.RT-PCR分析結果；B～F.qRT-PCR分析結果；*.P<0.05，**.P<0.01

BAY11-7028對WSN感染后這些基因的表達呈現相似的作用，其中NMB、IL-6 和IFN-α極顯著下降(P<0.01)，NMBR顯著下降(P<0.05)，NP極顯著上升(P<0.01)(圖2)。這些結果表明，BAY11-7028能有效抑制PR8和WSN感染誘導的NF-κB信號通路，暗示了PR8和WSN感染誘導MLE-12細胞中NMB和NMBR基因表達變化與NF-κB信號通路直接相關。

A.RT-PCR分析結果；B～F.qRT-PCR分析結果；*.P<0.05，**.P<0.01

2.2 BAY11-7028對PR8或WSN感染MLE-12細胞中相關蛋白表達水平的影響

收集并提取各組總蛋白，Western blot分析各組NMB、NMBR、p-P65、IκBα和NP蛋白表達變化。如圖3所示，與PR8或WSN感染組相比，BAY11-7028可促使PR8或WSN感染后的MLE-12細胞中NMB、NMBR和p-P65蛋白表達水平明顯降低，IκBα和NP蛋白表達水平上升。該結果表明，PR8和WSN感染誘導的MLE-12細胞中NMB和NMBR蛋白表達水平均與NF-κB信號通路有關。

圖3 WB分析BAY11-7028處理PR8或WSN感染MLE-12細胞后相關蛋白表達情況

2.3 NMB和BAY11-7028對PR8或WSN感染MLE-12細胞中相關基因轉錄水平的影響

qRT-PCR分析各組中IL-6、IFN-α和NP基因的轉錄水平的變化。結果顯示，與PR8感染組相比，NMB和BAY11-7028可誘導PR8感染后的IL-6、IFN-α和NP基因的轉錄水平出現變化(圖4)，其中IL-6(P<0.01)和NP(P<0.01)出現極顯著下降，IFN-α(P<0.01)顯著上升。NMB和BAY 11-7028也可誘導WSN感染后的IL-6、IFN-α和NP基因的轉錄水平出現變化，其中IL-6(P<0.01)和NP(P<0.01)出現極顯著下降，IFN-α(P<0.05)顯著上升(圖5)。這些結果表明，BAY11-7025可削弱外源性NMB對PR8或WSN感染誘導的MLE-12細胞中IL-6和IFN-α 基因轉錄水平的調節作用。

*.P<0.05, **.P<0.01

*.P<0.05, **.P<0.01

2.4 NMB和NMBRA對PR8或WSN感染誘導小鼠體內相關蛋白的影響

收集并提取各組總蛋白，通過Western blot分析p-P65、IκBα和NP蛋白的表達變化。結果顯示，與陰性對照組相比，PR8感染誘導小鼠肺組織p-P65和NP蛋白表達水平上升，IκBα蛋白表達水平下降；與PR8感染組相比，外源性NMB可抑制小鼠肺組織內p-P65和NP蛋白表達水平，促進IκBα蛋白表達水平；WSN感染小鼠的結果與PR8感染的結果基本一致(圖6)。NMBR抑制劑NMBRA聯合NMB可抵消NMB對PR8或WSN感染后的這些蛋白表達的調節作用(圖6)，這反向證明了NMB的作用效果。這些結果表明，NMB可以調節NF-κB信號通路的p-P65和IκBα的表達而發揮抗IAV/H1N1的先天性免疫應答反應。

圖6 Western blot分析NMB和NMBRA處理PR8或WSN感染小鼠后相關蛋白表達情況

3 討 論

NMB通過特異性結合受體NMBR參與調節機體內的生物學功能。本課題組前期研究發現，外源性NMB可以調控PR8感染誘導的宿主細胞和動物體內的IL-6和IFN-α基因的表達而發揮抗PR8感染的先天性免疫應答反應[31]，但其詳細作用機制尚不清楚。研究表明，神經肽家族的成員可通過誘導NF-κB表達而調節天然免疫和獲得性免疫[20-21]。NF-κB信號通路是體內抗病毒感染的信號通路，具有調控炎癥因子、干擾素和多種抗病毒因子表達的功能[27-29,32-35]，其活性能夠被NF-κB抑制劑有效抑制，如：BAY11-7028[36-37]等。A型流感病毒感染激活NF-κB信號通路后，可誘導IκBα蛋白表達和P65蛋白磷酸化及核轉移，從而影響下游細胞因子的表達[38-39]。這些研究暗示NMB參與宿主發揮抗IAV/H1N1感染可能與NF-κB信號通路密切相關。

為剖析NF-κB信號通路是否介導NMB發揮抗IAV/H1N1感染的先天性免疫應答反應，本研究發現BAY11-7028能夠抑制PR8和WSN感染MLE-12細胞中IκBα表達，增強P65活性，降低NMB和NMBR表達水平，這表明NMB和NMBR表達變化與PR8和WSN感染激活的NF-κB信號通路直接相關。因此，NMB/NMBR是如何通過NF-κB信號通路參與抗IAV感染誘導的先天性免疫應答反應值得進行研究。進一步的體外試驗結表明，外源性NMB可促使IAV/H1N1感染的MLE-12細胞中IL-6基因表達下降和IFN-α基因表達上升，這與前期的研究結果一致[31]。然而，外源性NMB和BAY11-7028共處理后誘導PR8和WSN感染MLE-12細胞中IL-6和IFN-α基因表達水平極顯著下降，該結果表明外源性NMB可通過NF-κB信號通路參與IAV/H1N1感染誘導的炎癥因子表達的調節作用。體內試驗結果也表明，外源性NMB可抑制PR8或WSN感染小鼠誘導的肺組織p-P65和NP蛋白表達水平，促進IκBα蛋白表達水平。NMBR抑制劑NMBRA聯合NMB可抵消NMB對PR8和WSN感染后的這些蛋白表達的調節作用，反向證實了上述NMB作用的可靠性。體內外試驗結果一致表明，NMB可通過調節NF-κB信號通路上的p-P65和IκBα的表達而影響IAV感染誘導的IL-6和IFN-α的表達，從而發揮抗IAV/H1N1的先天性免疫應答反應。

4 結 論

本文分別從體內和體外水平研究發現NMB/NMBR與IAV/H1N1感染誘導的NF-κB信號通路存在直接關聯，并且外源性NMB可通過調節IAV/H1N1感染誘導的p-P65和IκBα表達的作用，進而影響IAV/H1N1感染誘導的IL-6和IFN-α基因的表達水平。綜合這些結果表明，IAV/H1N1感染誘導的NMB和NMBR表達可通過NF-κB信號通路參與機體發揮抗IAV感染的先天性免疫應答反應, 這為深入了解宿主抗IAV/H1N1感染的免疫反應機制和開發新型抗IAV/H1N1的藥物提供更充足的理論依據。