幼年牦牛不同部位皮膚毛囊的組織學結構及TGF-β2與HIF-1α差異性表達分析

張 虔，崔 燕,2*，余四九,2，廖 博，鄒勝南，白雪峰，Seth Yaw Afedo，趙鵬飛，龍 敏

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070；2.甘肅省牛羊胚胎工程技術研究中心，蘭州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是我國青藏高原的特有牛種，長期生活于海拔3 000 m以上高寒、低氧的極度惡劣環(huán)境，擁有“高原之舟”的美譽[1]。皮膚作為保護機體免受外界干擾的第一道防線，在應對紫外線照射、物理或化學損傷及微生物感染等外界挑戰(zhàn)時發(fā)揮著重要作用[2]。皮膚由表皮、真皮及皮下組織構成，在真皮層中含有大量的皮膚附屬物，如毛囊、皮脂腺、汗腺等。毛囊是皮膚中控制毛發(fā)生長的微型器官，毛囊由內(nèi)向外依次由內(nèi)根鞘、外根鞘及結締組織鞘三部分構成。它擁有獨特的生長周期，在維持體溫等方面發(fā)揮重要的作用[3]。

Findlay和Yang[4]對艾爾郡奶牛頸側部和背部毛細血管的組織學結構進行了觀察和測量，發(fā)現(xiàn)毛細血管的周圍圍繞著兩個或多個毛囊群，測得背部毛囊直徑[(0.086±0.030)mm]顯著高于頸側部[(0.040±0.005)mm]。胡倩倩等[5]對皖東黃牛的毛囊組織學結構觀察發(fā)現(xiàn)，毛球主要呈球形，構成毛球的細胞深染，毛球末端為凹陷的毛乳頭。毛囊由表皮向真皮下陷而成，在真皮層內(nèi)傾斜排布。皖東黃牛毛囊與表皮的傾斜角度約70°，毛囊底部位于乳頭層深部和網(wǎng)狀層內(nèi)。王富金等[6]對延邊黃牛的毛囊結構觀察并進行相關統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，延邊黃牛的毛干呈淺黃色，每根毛有一個毛囊，毛囊密度為1 614.630 2 根·cm-2，且公畜的毛囊密度大于母畜的毛囊密度。牦牛的皮膚結構特性已有大量報道，岳靜[7]、于川等[8]通過對不同年齡牦牛皮膚23個部位測量發(fā)現(xiàn)，牦牛皮膚的厚度隨年齡的增加而逐漸增厚。楊雪等[9]對牦牛皮膚毛囊周期性結構變化規(guī)律進行研究，運用Sacpic染色更加具體的展現(xiàn)了生長期、退行期及休止期毛囊的結構特點。曹迷霞[10]對成年牦牛的皮脂腺和汗腺結構特點進行研究，發(fā)現(xiàn)成年牦牛的皮膚從背部到腹部存在漸變趨勢,與其他牛類相比，牦牛汗腺和皮脂腺的密度高，但前者的分泌功能不發(fā)達而后者發(fā)達，這可能與其為了適應高原高寒環(huán)境有關。

TGF-β2是TGF-β(transforming growth factor-β)超家族中的一員，它存在于哺乳動物體內(nèi)[11]。據(jù)報道，TGF-β家族在細胞增殖[12]、凋亡[13]、分化[14]等方面擁有著重要的作用，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]和纖維化[16]密切相關。而在毛囊的相關研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β家族成員能夠使毛囊退行期延遲，從而使毛囊周期發(fā)生改變[17]。然而在不同的物種中，TGF-β家族成員中行使動能的成員卻不盡相同。在小鼠中TGF-β1發(fā)揮著主要作用[11]，TGF-β2則是影響人類毛囊發(fā)生上皮細胞凋亡[13]。宋亮麗等[18]對TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3在牦牛毛囊周期的調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β2 mRNA在毛囊生長中期、生長晚期和退行期皮膚內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平，顯著高于同時期皮膚內(nèi)TGF-β1、TGF-β3 mRNA，說明TGF-β2在毛囊周期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要的作用。

低氧誘導因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)家族中的HIF-1α是機體適應低氧環(huán)境的關鍵調(diào)控因子[19]。1992年，Semenza和Wang[20]在Hep3B細胞株中發(fā)現(xiàn)HIF-1α是專一調(diào)節(jié)氧氣的HIF-1亞單位，它能夠與靶基因結合，促進其轉(zhuǎn)錄，使機體產(chǎn)生一系列缺氧適應反應。在低氧條件下，HIF-1α通過激活許多基因的轉(zhuǎn)錄，如參與能量代謝、血管生成、凋亡等，合成相應的蛋白質(zhì)以增加氧的釋放，使機體適應低氧環(huán)境[21]。李勇堅等[22]對HIF-1α與 iNOS在銀屑病皮損中的表達及其與血管生成的關系研究中發(fā)現(xiàn)，銀屑病皮損組織存在HIF-1α和iNOS蛋白的過表達, 可能通過促進銀屑病新生血管的生成, 對銀屑病的發(fā)生發(fā)展起重要作用。另有戴葉芹等[23]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在體外具有促進人毛囊生長和增加毛囊成纖維細胞及真皮鞘細胞活性。

牦牛作為季節(jié)性發(fā)情動物，于7～8月為發(fā)情高峰，在4～5月為繁殖旺季[24]。半歲幼年牦牛多處于高原的冬季，此時牦牛皮膚的結構完整性是冬季正常生存的重要保障，而關于幼年牦牛皮膚的組織結構特性鮮見報道。為探尋幼年牦牛皮膚毛囊結構特點及毛囊生長的分子調(diào)控機制，本試驗首先采用HE和Sacpic染色法對幼年牦牛皮膚毛囊結構進行觀察并對毛囊數(shù)量進行計數(shù)，篩選出多毛皮膚和少毛皮膚，其次采用免疫組化、Western blot及qRT-PCR法，對TGF-β2及HIF-1α在幼年牦牛皮膚多毛部位和少毛部位進行定位和定量研究。以探究TGF-β2及HIF-1α對幼年牦牛毛囊生長發(fā)育的影響，并為后期探究牦牛皮膚高海拔適應性分子調(diào)控機制提供資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

從青海西寧樂家灣選取10頭健康幼年牦牛(5～6月齡)。采用頸部放血的方法處死試驗動物后，采集牦牛頸部、背部、胸部、腹部、小腿部、腋下和陰囊皮膚，一部分組織樣放置于4%的多聚甲醛溶液中固定2周，用于毛囊計數(shù)和免疫組化；另一部分分子樣迅速放置于液氮中，運輸至實驗室放置于-80 ℃ 冰箱中，用于后期qRT-PCR和Western blot試驗。

1.2 試驗方法

從4%的多聚甲醛固定液中取出皮膚組織，切成0.4 cm×0.4 cm×0.5 cm大小的組織塊，采用常規(guī)石蠟切片包埋，制作4～5 μm厚的連續(xù)切片，采用HE和Sacpic染色法進行染色，利用Olympus DP71顯微照相系統(tǒng)進行觀察并攝片。

1.2.1 Sacpic染色法 切片脫蠟至水，自來水潤洗后天青石藍B染液染色5 min，經(jīng)自來水潤洗后，Weigert’s 蘇木精染液染色5 min，自來水潤洗后返藍水(0.5 g碳酸氫鈉、5 g硫酸鎂和500 mL蒸餾水充分混勻)返藍3 min，自來水潤洗后置于沙黃染液中5 min，分別用70%酒精和95%酒精分化，苦味酸乙醇飽和溶液3 min，再用95%酒精和70%酒精分化，自來水潤洗后靛藍胭脂紅染色1 min，自來水潤洗，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.2.2 實時熒光定量PCR 取不同部位皮膚，研磨后置于冰盒上，用TriQuick Reagent法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將其反轉(zhuǎn)為cDNA后，進行PCR及實時熒光定量PCR試驗。反應體系20 μL。根據(jù)GenBank中黃牛(Bostaurus)TGF-β2、HIF-1α、β-actin基因序列，采用 Primer Premier6.0軟件設計，并由華大基因合成，qRT-PCR 引物序列和基因序列號如表1所示。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

1.2.3 Western blot 將采取的幼年牦牛背部、腋下、腹部及陰囊皮膚分別研磨后，各稱取0.1 g于離心管中，每管加入1 mL的RIPA和10 μL PMSF，勻漿1.5 h，4 ℃，12 000×g離心5 min，吸取上清液至新的離心管，用ND-1000(Nano Drop Technologies)測定蛋白濃度后并進行調(diào)整。將蛋白與4×SDS-PAGE loading buffer 3∶1的比例混合，沸水浴10 min，將蛋白變性。用等量變性的蛋白上樣并進行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗孵育(Mouse Anti-TGF-β2，ab-36495，1∶1 000稀釋；Mouse Anti-HIF-1α，ab-16066，1∶1 000稀釋；β-actin，1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜。用PBST清洗PVDF膜后，二抗孵育(HRP標記的鼠二抗，1∶2 500)，室溫1 h，用PBST清洗PVDF膜后，ECL化學發(fā)光液顯色并觀察結果。條帶結果用Image J軟件測定各條帶灰度值，從而得出TGF-β2及HIF-1α在幼年牦牛不同皮膚中的相對表達量。

1.2.4 免疫組織化學染色 切片脫蠟至水后，放入pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液進行微波加熱修復，待溶液冷卻至室溫后，用PBS洗3 min×3，3%過氧化氫溶液(來自SP試劑盒)37 ℃ 15 min, 用PBS洗3 min×3，正常山羊血清(來自SP試劑盒)，室溫封閉10 min，傾去勿洗，一抗孵育(TGF-β2，ab-36495，1∶1 000稀釋；HIF-1α，ab-16066，1∶1 000稀釋)，4 ℃，過夜。復溫20 min，用PBS洗3 min×3，二抗孵育(SP試劑盒B液)，37 ℃ 15 min，用PBS洗3 min×3，三抗孵育(SP試劑盒C液)，37 ℃ 15 min，用PBS洗3 min×3，DAB顯色，在顯微鏡下觀察并控制顯色，自來水終止反應。蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化，自來水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 數(shù)據(jù)測量及統(tǒng)計分析

毛囊計數(shù)：組織蠟塊橫切，連續(xù)切片隔3取1，各部位各取40張切片，對毛囊進行計數(shù)。

2 結 果

2.1 不同部位皮膚毛囊的組織結構及數(shù)量

2.1.1 不同部位皮膚毛囊的結構 幼年牦牛的毛囊主要分布在真皮層，由內(nèi)向外依次由內(nèi)根鞘、外根鞘和結締組織鞘組成，不同部位的毛囊組織學結構基本相似，毛囊底部膨大形成毛球(圖1B)，頸部(圖1D)、背部(圖1G)、小腿部(圖1H)、腋下(圖1I)和陰囊(圖1 J)皮膚中，大多數(shù)毛干的毛髓質(zhì)及毛囊內(nèi)根鞘結構不完整；腹部(圖1E)和胸部(圖1F)皮膚依然清晰可見毛囊三層結構，毛囊處于退行期。Sacpic染色可見毛囊內(nèi)根鞘為紅色，外根鞘為蒼綠色，結締組織鞘為藍綠色(圖1C)。

A.腹部皮膚縱切，Sacpic染色，100×；B.背部皮膚縱切，Sacpic染色，100×；C.胸部皮膚縱切，Sacpic染色，100×；D.頸部皮膚縱切，HE染色，100×；E.腹部皮膚橫切，HE染色，100×；F.胸部皮膚縱切，HE染色，100×；G.背部皮膚縱切，HE染色，200×；H.小腿部皮膚橫切，HE染色，200×；I.腋下皮膚縱切，HE染色，100×；J.陰囊皮膚縱切，HE染色，100×；K.陰囊皮膚縱切，HE染色，200×；L.腋下皮膚縱切，HE染色，100×。EP.表皮；DE.真皮；HF.毛囊；IRS.內(nèi)根鞘；ORS.外根鞘；CTS.結締組織鞘；SWS.汗腺的分泌部；SWD.汗腺的導管部；SEG.皮脂腺

2.1.2 不同部位皮膚毛囊的數(shù)量 幼年牦牛毛囊的數(shù)量從腹部、背部、胸部、小腿部、頸部、腋下及陰囊依次遞減，且部位間差異顯著(P<0.05)(表2)。

表2 幼年牦牛不同部位皮膚毛囊的數(shù)量

2.2 qRT-PCR檢測TGF-β2及HIF-1α基因的表達

采用qRT-PCR對TGF-β2及HIF-1α基因的表達進行定量研究，β-actin(圖2A)、TGF-β2(圖2B)及HIF-1α(圖2C)基因擴增產(chǎn)物大小分別為174、98和82 bp，各個基因的擴增產(chǎn)物大小與預期片段大小相符，引物特異性強，可用于后續(xù)qRT-PCR試驗。實時熒光定量結果顯示，TGF-β2在陰囊皮膚和腋下皮膚的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于背部皮膚和腹部皮膚(P<0.05)(圖2D)。HIF-1α在腹部皮膚的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他三個部位(P<0.05)(圖2E)。

A～C.β-actin、TGF-β2及HIF-1α基因擴增產(chǎn)物；D～E：TGF-β2及HIF-1α基因在幼年牦牛不同部位中的表達；M.DNA 相對分子質(zhì)量標準；1.背部；2.腋下；3.腹部；4.陰囊；不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 Western blot檢測TGF-β2及HIF-1α蛋白的表達

2.3.1 TGF-β2在幼年牦牛多毛皮膚和少毛皮膚內(nèi)的蛋白表達檢測 Western blot結果顯示，TGF-β2在幼年牦牛多毛皮膚(背部和腹部)及少毛皮膚(腋下和陰囊)中均有表達，在陰囊、腋下、腹部及背部中的表達依次呈遞減趨勢，且各部位之間差異顯著(P<0.05)(圖3B)。

A.Western blot結果；B.TGF-β2蛋白的相對表達；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.3.2 HIF-1α在幼年牦牛多毛皮膚和少毛皮膚內(nèi)的蛋白表達檢測 Western blot結果顯示，TGF-β2在幼年牦牛多毛皮膚(背部和腹部)及少毛皮膚(腋下和陰囊)中均有表達，腹部表達量顯著高于其他三個部位(P<0.05)(圖4B)。

A.Western blot結果；B.HIF-1α蛋白的相對表達；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.4 免疫組織化學法對TGF-β2及HIF-1α表達部位進行定位

免疫組織化學結果顯示，TGF-β2在背部皮膚和腋下皮膚呈強陽性表達，而在腹部皮膚和陰囊皮膚呈弱陽性表達。TGF-β2在皮膚的不同部位表達相似，主要表達在表皮層、毛囊外根鞘、皮脂腺及汗腺(圖5A1～D2)。HIF-1α表達部位基本相似，主要表達在表皮層、毛囊內(nèi)根鞘、毛囊外根鞘、皮脂腺及汗腺(圖5A3～D4)。

A1.背部皮膚縱切，100×；A2.背部皮膚縱切，400×；A3.背部皮膚縱切，100×；A4.背部皮膚縱切，200×；A5.背部皮膚縱切，陰性對照，400×；B1.腋下皮膚縱切，100×；B2.腋下皮膚縱切，400×；B3.腋下皮膚縱切，100×；B4.腋下皮膚縱切，200×；B5.腋下皮膚縱切，陰性對照，100×；C1.腹部皮膚縱切，200×；C2.腹部皮膚縱切，400×；C3.腹部皮膚縱切，200×；C4.腹部皮膚縱切，400×；C5.腹部皮膚縱切，陰性對照，400×；D1.陰囊皮膚縱切，100×；D2.陰囊皮膚縱切，200×；D3.陰囊皮膚縱切，100×；D4.陰囊皮膚縱切，200×；D5.陰囊皮膚縱切，陰性對照，200×。EP.表皮；HF.毛囊；SW.汗腺；SEG.皮脂腺

3 討 論

3.1 不同部位皮膚毛囊的組織結構及數(shù)量

本研究發(fā)現(xiàn)，幼年牦牛的皮膚毛囊結構松散，毛髓質(zhì)及內(nèi)根鞘結構不完整，毛囊處于退行期，成年牦牛毛囊結構完整，結締組織鞘和外根鞘較厚[10]。HE染色可以分析皮膚整體組織學結構，但毛囊細微結構的內(nèi)根鞘、外根鞘和結締組織鞘難以辨析，而Sacpic染色可以清晰地將牦牛毛囊組織學結構展現(xiàn)出來。通過對半歲牦牛的各部位皮膚毛囊計數(shù)，幼年牦牛腹部的毛囊數(shù)量最多，這與成年牦牛頸部毛囊數(shù)量較多的結果不一致，這可能是由于兩個部位間皮膚厚度而引起的環(huán)境適應性規(guī)律變化。研究發(fā)現(xiàn)幼年時牦牛的腹部皮膚比頸部皮膚薄，為了抵御嚴寒的高原環(huán)境，腹部需要有更多的毛發(fā)來減少熱量的散失,當發(fā)育為成年牦牛時，牦牛腹部皮膚比頸部皮膚厚，隨著對環(huán)境的適應，動物機體對自身作出調(diào)整，毛囊數(shù)目減少[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)了幼年牦牛的腋下及陰囊部位皮膚中毛囊較為稀疏，導致的原因可能有兩種，一是由于腋下部位深，向內(nèi)凹陷，相對其他部位封閉，容易積聚熱量。二是由于腋下部位是大血管和淋巴管流經(jīng)地，離皮膚近，其內(nèi)熱量易散于此處。陰囊部位毛囊稀疏可能由于體內(nèi)溫度過高，不利于精子發(fā)育，睪丸需脫出體外，導致陰囊部位皮薄毛少[25]。

3.2 TGF-β2及HIF-1α在幼年牦牛多毛皮膚和少毛皮膚定位和定量研究

哺乳動物的毛發(fā)周期包括3個時期，即生長期、退行期和休止期。脫發(fā)是由于多種原因?qū)е旅疫^早進入退行期的結果，比如雄激素[26]、抗癌藥物[27]和炎癥反應[28]等。退行期細胞凋亡主要發(fā)生在毛乳頭周圍的毛基質(zhì)細胞和外根鞘的外層細胞[29]。TGF-β超家族能夠促進這些細胞的凋亡，從而使得毛囊的退行期提前發(fā)生。而TGF-β2可能是TGF-β超家族成員中在牦牛的體內(nèi)主要發(fā)揮作用的因子，且該過程可能通過 TGF-βRⅡ介導途徑誘導牦牛毛囊上皮細胞發(fā)生凋亡來實現(xiàn)[17]。半歲的幼年牦牛腋下皮膚和陰囊皮膚毛囊數(shù)量少，腹部皮膚和背部皮膚毛囊數(shù)量多。通過對這4個部位的TGF-β2蛋白和基因檢測，作者發(fā)現(xiàn)TGF-β2在腋下皮膚和陰囊皮膚的表達量高，在背部和腹部的表達量低。在毛囊較少的部位表達量高，這可能表示，TGF-β2亦可以抑制毛囊生長。

牦牛長期生活在高寒低氧的環(huán)境中，低氧誘導因子是牦牛適應低氧環(huán)境的重要轉(zhuǎn)錄因子。低氧誘導因子作為一種轉(zhuǎn)錄因子, 低氧時廣泛表達在各組織細胞中, 如腎、肝、肺、腦、心等和許多細胞系, 它和低氧反應有關的基因中的低氧反應元件(HRE)上的HIF-1結合位點結合, 介導低氧反應[30]。在惡性腫瘤增長的過程中，其內(nèi)部容易形成缺氧的狀態(tài)，腫瘤細胞適應缺氧環(huán)境的策略有兩種，一種是提高糖酵解速率;另一種是血管的再生，增加輸氧能力。HIF-lα可以通過增強靶基因如促紅細胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及糖酵解酶等基因轉(zhuǎn)錄來刺激血管新生[31]。在用去鐵草酰胺(DFO)處理的真皮乳頭細胞中，HIF-1α的穩(wěn)定性增加，去鐵氧胺是一種促進HIF-1α穩(wěn)定的化學羥化酶抑制劑[32]。通過促進糖酵解來穩(wěn)定HIF-1α可以減少氧化應激并促進毛發(fā)生長。在對成年牦牛皮膚中HIF-lα進行研究的基礎上[33]，本試驗對背部、腋下、腹部及陰囊皮膚的HIF-1α蛋白和基因的表達量檢測發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在腹部表達量比其他三個部位高，而腹部屬于多毛皮膚，這和預期試驗結果相一致。說明HIF-1α可能具有促進毛囊生長的作用。

4 結 論

幼年牦牛各部位皮膚組織學結構基本相似，毛囊處于退行期。腹部毛囊數(shù)量最多，背部次之，陰囊最少。TGF-β2和HIF-1α在不同部位皮膚中的表達水平存在顯著差異，TGF-β2在少毛皮膚中相對表達量較高，而HIF-1α在多毛皮膚中相對表達量較高，推測TGF-β2和HIF-1α在毛囊生長中發(fā)揮重要作用。