病毒的鋅指蛋白在病毒感染中的作用

鄧學文，汪銘書*，程安春

(1.四川農業大學動物醫學院 禽病防治研究中心，成都 611130；2.四川農業大學動物醫學院預防獸醫研究所，成都 611130；3.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130)

鋅指(zinc fingers, ZF)結構是一套廣泛的蛋白結構元件，其通過結合Zn2+來穩定一種很短的可以自我折疊的蛋白結構[1]，鋅指蛋白(zinc-finger protein, ZNF)是迄今在真核生物基因組中分布最廣的蛋白之一[2]，可見ZF結構在真核生物生命進程中扮演著十分重要的角色。許多病毒也可以編碼具有ZF結構的蛋白且該結構的改變會影響病毒的生物學特性，本文對常見的病毒ZF結構蛋白在病毒感染中所發揮作用的研究進展作一綜述，以期為ZNF的研究提供參考。

1 鋅指蛋白的結構與種類

鋅指(zinc fingers, ZF)結構是一種通過肽鏈中的半胱氨酸或組氨酸與鋅離子結合后自我折疊形成的指狀空間結構[3]，其定義為：在一段氨基酸序列中，有幾個固定位置的半胱氨酸(cysteine，C)殘基或組氨酸(histidine，H)殘基，這些殘基與Zn2+特異性結合后，肽鏈旋轉折疊形成一種穩定的三維手指狀結構，這一結構被稱為ZF結構[4]。鋅指蛋白(zinc-finger proteins，ZNFs)通常是指由一系列具有重復結構的ZF結構組成的蛋白質，可與DNA、RNA以及其他蛋白相結合并產生相互作用，從而對生物的生命過程起到調節作用，在真核生物中研究頗為廣泛[5]。非洲爪蟾卵母細胞中的轉錄因子TF IIIa(transcription factor IIIa)是第一個被鑒定為含有ZF結構的蛋白[6-7]，自此，研究人員開始對該領域展開研究。越來越多的研究表明，許多病毒也可以編碼合成ZNF，且該蛋白結構的改變會影響病毒的生物學特性，可見ZNF在病毒生命周期中扮演著十分重要的角色[8]。目前，已知的ZF結構有很多種類，根據其保守結構域的不同以及半胱氨酸和組氨酸的數目和位置，可分為C2H2、C2HC、C3H、C4、C6、C4HC3、C3HC4、聯合型等多種類型[9]。最為常見的是C2H2型ZF，該ZF含有兩個半胱氨酸與兩個組氨酸，分別與鋅離子絡合后通過1個α螺旋與2個反向β折疊形成一個手指狀結構[10]。

2 病毒鋅指蛋白在病毒感染中的作用

病毒感染是指病毒通過多種途徑侵入機體，在易感宿主細胞中增殖并釋放到細胞外再侵入鄰近細胞的過程。目前，發現能編碼ZNF的病毒包括：1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、鼠白血病病毒(MuLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、部分皰疹病毒(herpes virus)、冠狀病毒(CoV)[11]、蝦白斑綜合征病毒(WSSV)[12]等。下文將對目前病毒的ZNF在病毒感染中所發揮作用的研究進展進行概述。

2.1 逆轉錄病毒鋅指蛋白對病毒感染的影響

逆轉錄病毒侵入宿主后，在逆轉錄酶的作用下，以病毒基因組RNA為模板合成cDNA，之后再以該DNA為模板進行轉錄、翻譯等一系列生命活動[13]。絕大部分逆轉錄病毒的核衣殼蛋白(nucleocapsid，NC)域包含1～2個ZF結構-C2HC(圖1)，ZF之間由基本序列29RAPRKKG35連接[14]，該結構高度保守，對病毒基因組RNA組裝期間的識別和包裝具有重要作用，參與病毒的早期感染[15-16]。

圖1 NC區域ZF結構示意圖[17]

研究證明，逆轉錄病毒的NC蛋白結構域可以與病毒編碼的Tat蛋白產生互作，NC蛋白通過在胞質中堆積來阻礙Tat蛋白介導的病毒mRNA的轉錄以及翻譯，從而調節病毒的復制[18]。NC蛋白還能與宿主蛋白Alix發生相互作用，Alix是一種內吞體分選轉運復合體(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)，介導內吞小泡出芽和多泡體(multivesicular bodies，MVBs)的形成[19]，其擁有2個結構域：N端回形域Bro1和中心V型結構域，NC蛋白可以與Bro1相結合，參與病毒的釋放[20]。

2.1.1 人類免疫缺陷病毒NC蛋白 人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的NC蛋白是HIV的Gag蛋白的前體多蛋白(pr55Gag)的N末端蛋白[21-22]。pr55Gag蛋白參與形成寡聚體支架，促進病毒基因組RNA的組裝，形成新的感染顆粒[23-24]，是病毒在反轉錄過程中的主要結構蛋白。病毒組裝集中在病毒衣殼的主要結構蛋白——Gag蛋白上，該蛋白是一個55 ku的多聚蛋白[25]，包含4個主要的子域，即基質(MA)、衣殼(CA)、核仁(NC)和p6。其中，NC在病毒粒子的組裝、萌芽以及成熟階段皆具有重要功能。首先，作為逆轉錄病毒的復制核心蛋白，NC在其內部穩定的ZF基序作用下可行使核酸伴侶功能，即與基因組RNA形成二聚體，并促進其反轉錄的發生[26-28]。其次，NC蛋白能募集大量宿主蛋白，包括肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白、親環蛋白A、泛素以及賴氨酰-tRNA合成酶和許多RNA結合蛋白[29-30]，其中，雙鏈RNA結合蛋白Staufen1[31]是一種參與mRNA轉運和翻譯的宿主因子，NC蛋白與Staufen1相互作用調節病毒復制周期中的多個步驟，如Gag多聚化和基因組RNA衣殼化。Gag介導子代病毒顆粒衣殼的形成[32-33]，NC蛋白通過激活PKR和破壞多囊泡來誘導病毒組裝的發生，Staufen1通過結合和隔離NC蛋白并與RNA結合從而穩定多核糖體來破壞NC誘導的病毒粒子裝配。研究表明，T細胞是HIV感染的靶細胞，通常在淋巴器官中呈極化形態，極化T細胞具有前緣區與尾足區兩端，HIV的Gag會在其尾足區富集。受感染的T細胞通過富集有Gag蛋白的尾足與未感染T細胞接觸，這個接觸區域可能在病毒胞間傳遞中起著重要作用[34]，被稱為病毒突觸(virological synapse，VS)。Llewellyn等[35]發現，NC蛋白能驅使Gag在極化的T細胞尾足區富集，促進VS的形成，為病毒的胞間感染傳播提供平臺，而NC蛋白的缺失將導致病毒胞間傳遞受阻。NC蛋白含有兩個ZF結構域[36]，Boutant等[37]通過對該區域進行兩種突變，分別將核衣殼蛋白ZF域23位和44位的半胱氨酸替換為組氨酸，電鏡下觀察病毒的包裝過程并未出現問題，但胞間感染能力卻大大降低。相關研究證明，NC蛋白內源性逆轉錄(reverse transcription，ERT)是部分RNA病毒的一種逆轉錄方式[38]，NC蛋白ZF結構的突變會導致病毒的蛋白酶失活，使病毒拷貝數明顯下降[39]，這說明HIV病毒的NC蛋白內源性逆轉錄與病毒感染性之間存在因果關系。

2.1.2 小鼠白血病病毒Ncp10蛋白 小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MuLV)是一種可引起小鼠白血病和神經系統疾病的逆轉錄病毒[40]，其核衣殼蛋白Ncp10的ZF結構最早于1995年被Darlix等[41]發現并報道，Gorelick等[42]對該病毒核衣殼區域ZF結構進行了兩種突變：CCCC和CCHH，兩種突變病毒都可正常組裝基因組，但是突變病毒的堿基出現缺失，DNA復制能力大幅降低，證明在MuLV感染宿主時，其NC蛋白中完整且嚴格保守的ZF結構是病毒復制所必需的。Gorelick等[43-44]還對MuLV的核衣殼蛋白中的一個C2HC ZF結構進行了兩種點突變，使原39位的半胱氨酸突變為組氨酸以及使原來34位的組氨酸突變為半胱氨酸，結果證明，兩種突變體病毒都可以表達出正常數量的Gag前體蛋白以及Env包膜蛋白，且突變株均包含了病毒的全長RNA，但是兩株突變體無法合成cDNA，感染能力僅為親本株的4×10-4倍，即幾乎沒有感染能力。除了對ZF結構的突變，Housset等[45]針對ZF側堿性氨基酸也進行了突變，通過使用中性氨基酸將15到18位的ERRR殘基以及40～42位的PKK殘基進行多種替換和突變，發現當用1或2個中性氨基酸取代原來的堿性殘基后并不會影響成熟病毒粒子的產生，但病毒的胞間傳播能力皆減弱，當超過2個基本殘基被中性氨基酸取代時，逆轉錄起始及基因組RNA二聚體包裝發生嚴重缺陷，病毒胞間傳播極度減弱。這些結果說明，NCp10 ZF區域的穩定是MuLV感染性病毒粒子增殖所必需的。

2.1.3 猴免疫缺陷病毒NC蛋白 Gorelick等[46]對猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)的核衣殼區域兩個ZF結構進行了9種突變，所得到的突變病毒均可表達出正常的病毒蛋白，且表達量與親本株沒有顯著差異，電鏡觀察所有突變病毒都具有與親本株中未成熟病毒粒子相似的形態，然而，突變體的體外復制能力卻明顯下降，其感染性是野生型病毒的10-5～10-6倍。其中一個缺失了第2個ZF區域第33到第36位氨基酸的突變體病毒靜脈注射到豚尾獼猴體內時，病毒喪失了感染能力。這說明SIV核衣殼蛋白ZF突變體病毒在體外和體內均存在復制缺陷。為了找出突變病毒失去感染性的原因，Akahata等[47]還進一步通過定量PCR檢測了SIV感染細胞不同時間后突變病毒cDNA的合成量，證明了ZF結構突變體病毒感染能力減弱，部分原因是病毒cDNA合成減少以及基因組RNA的包裝效率降低。Yovandich等[48]構建了6株在NC區域2個ZF中半胱氨酸殘基被刪減或替換的SIV突變病毒，這些突變體病毒均存在復制缺陷，通過電鏡觀察發現，點突變或缺失病毒的表型相似，與野生型病毒粒子相比，病毒粒子含有濃縮的核，核的電子密度更小；ZF遠端的突變以及兩種ZF中的點突變都可導致Gag蛋白的加工不完整，病毒粒子中的全長基因組RNA的轉錄水平降低約30%；同時，ZF中半胱氨酸殘基以及它們之間的基本鏈接區域缺失的突變體病毒可以有效的完成Gag前體蛋白的加工，但其基因組RNA的包裝僅僅為野生型病毒水平的10%，所產生的病毒粒子顆粒在大小和核心形態上也是異常的。這些結果表明，ZF結構基序的完整是Gag前體的正常加工和NC蛋白穩定表達的前提，也是影響病毒感染能力的重要因素。

2.2 皰疹病毒鋅指蛋白對病毒感染的影響

2.2.1 皰疹病毒US10 蛋白 研究證明，HSV-1[49]、ILTV[50]、DPV[51-53]的US10蛋白均含有13個氨基酸構成的保守序列，經推測，該序列編碼的氨基酸最終表達為C2H2型ZF結構蛋白。Ma等[54]通過細菌人工染色體[55](bacterial artificial chromosome，BAC)平臺構建了鴨瘟病毒US10基因缺失毒株，在感染鴨胚細胞后發現，該重組病毒的滴度下降了10～100倍，但定量檢測顯示，缺失株與親本株的基因組拷貝數無明顯差異，推測US10蛋白的ZF結構主要影響皰疹病毒感染性病毒粒子的包裝，對其基因組的復制無明顯影響。

2.2.2 皰疹病毒UL52蛋白 單純皰疹病毒1型(HSV-1)編碼了一種由UL5、UL8和UL52編碼蛋白組成的解旋酶/引物酶異源三聚體復合物。作為大型多蛋白分子復合物的一部分，解旋酶和引物酶在結構和功能上存在關聯，并與其他幾個復制體蛋白相互作用[56]。UL52蛋白C端含有保守的引發酶基序，其中包括一個ZF基序。然而，HSV-1和HSV-2 的UL52蛋白在986位置是一個亮氨酸殘基，大多數其他皰疹病毒在這個位置是一個苯丙氨酸殘基，Chen等[57]將該位置的亮氨酸替換為苯丙氨酸，發現突變體病毒引發酶的活性大幅降低(約為野生型的25%)。由于該突變位點位于UL52的ZF結構中，是否是該突變引起ZF結構和功能的改變，從而導致UL52功能變化有待考證，以及該ZF結構對引發酶的具體影響機制，還需做更深一步探究。

2.2.3 單純皰疹病毒1型的ICP0蛋白 HSV-1的ICP0蛋白是病毒立即早期基因ICP0編碼的一種重要的轉錄調控蛋白，可刺激潛伏狀態病毒發生增殖性感染。該蛋白具有一段C3HC4ZF結構域，早期研究發現，定點突變該結構域中任何一個半胱氨酸或組氨酸都將導致病毒轉錄激活失敗，并且ICP0的核內定位發生改變[58]。牛皰疹病毒1型(bovine herpesvirus 1，BoHV-1)屬于皰疹病毒科皰疹病毒甲亞科成員，是一種α皰疹病毒病[59]。在BoHV-1ICP0基因中有一段ZF序列-C3HC4，該ZF被認為用于激活病毒胸苷激酶(TK)基因啟動子從而激活病毒的增殖性感染，Inman等[60]首先報道該ZF結構對病毒的毒力具有重要作用，缺失了356～677位氨基酸的ZF結構突變將導致ICP0的亞細胞定位發生改變，無法激活TK啟動子。Saira等[61]將該ZF結構中51位半胱氨酸突變為甘氨酸，發現相對于正常的BoHV-1，突變病毒表達了更多的ICP0蛋白，但檢測到其在牛的細胞中的病毒滴度卻有下降，并且其表達的突變蛋白無法反式激活病毒TK的啟動子，表明ICP0高度保守的ZF結構對激活病毒轉錄和病毒裂解性感染至關重要。

2.3 其他病毒鋅指蛋白對病毒感染的影響

尼多病毒(Nido viruses)目編碼的一種非結構蛋白，在動脈病毒中被稱為nsp10，在冠狀病毒中被稱為nsp14，包含一個解旋酶域和N端鋅結合域(ZBD)[62]。研究證明，小動脈病毒的nsp10 ZBD突變體(Ser-59→Pro)的解旋酶活性受到顯著破壞，導致基因組mRNA合成不足。在反向遺傳學研究中，大多數這些ZBD突變使該病毒無法生存[63]。馬動脈炎病毒(equine arteritis virus,EAV)的nsp10的ZBD對病毒復制也是必不可少的[64]。Seybert等[65]構建了38種nsp10 ZBD突變體，ZBD 突變體具有復制和轉錄能力，但不產生傳染性子代病毒，且EAV ZBD突變體mRNA的轉錄水平降低到正常水平的1%以下，這說明EAV的ZF對于該病毒的感染性至關重要。嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)的nsp14結構域包含5條β鏈組成的β折疊[66], 在β-折疊片的兩邊都存在ZF，外切核糖核酸酶(ExoN)的活性依賴于非結構蛋白nsp14中ZBD的存在[67-68]，nsp14的ZBD位點突變破壞了nsp14 ZF結構，導致nsp14酶活性減弱，表明SARS-CoV的ZNF在催化病毒RNA合成中具有一定調節作用[69]。總的來說，病毒的ZF結構能夠通過對病毒解旋酶活性的調控作用參與病毒的基因組復制或者轉錄過程，從而對病毒的生命周期起到調節作用，影響病毒感染的效率。

2.4 病毒鋅指蛋白參與天然免疫調節

2.4.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒nsp1α蛋白 豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的妊娠母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為特征的一種傳染病[70]。NLRP3炎性體作為先天免疫的重要組成部分，在宿主抗病毒免疫中發揮著極其重要的作用[71-72]。研究表明，PRRSV可以激活NLRP3炎性小體，誘導促炎性細胞因子IL-1β分泌[73]。PRRSV的非結構蛋白1α(nsp1α)是病毒的重要免疫抑制蛋白，可抑制IFN-β轉錄和TNF-α的產生等[74-75]，其N端有一個ZF結構域[76]，王超等[77-78]通過刪除或突變該ZF域氨基端，發現突變體未能阻止poly(I:C)誘導炎癥小體啟動子的激活并釋放β干擾素。該研究首次表明，nsp1α有能力抑制NLRP3 炎癥體所介導的β干擾素分泌，且ZF結構的高度保守對nsp1α抑制NLRP3介導的β干擾素釋放至關重要。但是，該ZF結構在nsplα行使功能時所起到的具體作用機制還有待探究。

2.4.2 人巨細胞病毒US10蛋白 人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)入侵宿主后，可以干擾T細胞的識別功能以及自然殺傷細胞(nature kill，NK)的毒性作用，從而參與免疫逃避作用[79-80]。NK細胞的激活取決于表面受體HLA-G，HLA-G可抑制外周血NK細胞對Ⅰ型人類B細胞系721.221的殺傷作用[81-82]。Park等[83]研究發現，HCMV的US10蛋白定位于細胞內質網，可以干擾HLA-G在內質網的加工過程，降低HLA-G在膜表面的表達量，使NK細胞免疫作用紊亂，從而完成病毒免疫逃避。

2.4.3 冠狀病毒 nsp14蛋白 冠狀病毒(CoV)非結構蛋白 14(nsp14)是復制-轉錄復合物的一部分。SARS-CoV 的nsp14 結構中存在3個ZF[84]，它是一種雙功能酶，具有 3′ 到 5′外切核糖核酸酶(ExoN)和鳥嘌呤-N7-甲基轉移酶(N7-MTase)活性[85-86]。nsp14 N7-MTase 活性對防止宿主免疫系統識別病毒 RNA 至關重要[87]。Case等[88]使用傳染性胃腸炎病毒(TGEV)作為Alphacoronavirus模型，構建了一組nsp14點突變病毒，其中ZF 1(ZF-C)的特定突變體(rTGEV-ZF-C)與親本病毒相比，rTGEV-ZF-C導致細胞病變效應和細胞凋亡水平降低，在感染后期dsRNA 積累水平降低，導致β干擾素(IFN-β)、腫瘤壞死因子(TNF)刺激基因拷貝數降低，都證實了該突變體引發的宿主抗病毒反應水平降低。總體而言，該研究揭示了ZF 在病毒抵抗天然免疫反應中的潛在作用。這為抗病毒策略提供了新的思路。

3 展 望

ZF特殊的空間結構使得它可以與特定的核酸或者蛋白相互作用，對病毒在感染宿主細胞中具有重要作用。目前，對ZNF的研究主要集中于抗病毒以及抗癌方面的研究[89-93]，研究證明，某些Cys-Cys-Cys-His(CCCH)型ZNF，在免疫系統中起重要作用[94]，對病毒ZF結構和功能的深入研究，有利于人們理解病毒在宿主體內的感染機制，也有利于抗病毒藥物的研發。靶向ZF基序的化合物可廢除逆轉錄病毒(如HIV-1和MuLV)的感染性，但是單純靶向于ZF的藥物無法鑒別宿主與病毒的ZF，毒性較大具有明顯副作用，這也是目前沒有研發出高安全性的商品化藥物的原因之一。相信未來研究人員會攻克這一難題。