太行雞FST基因克隆、序列特征及表達分析

張貝貝，李夢霄，馬騰壑，2*，李雪男，魏佳榮，康國磊，王紅娜，劉 超，王 斌，孫研研

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲 056038；2.河北工程大學醫學院，邯鄲 056038；3.河北天凱食品有限責任公司，沙河 054100；4.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 農業部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室，北京 100193)

卵泡抑素(follistatin,FST)于1987年被Ueno 等[1]首次從卵巢卵泡液中發現，并證明其能抑制垂體前葉的卵泡刺激素分泌。FST以糖蛋白的形式廣泛存在于血清和組織，被認為是轉化生長因子β超家族成員的天然抑制劑，其存在形式為單體多肽，可產生分子量為31～42 ku的生物活性蛋白，包括肌肉生長抑素和激活素[2-4]。大量研究表明，FST在哺乳動物的組織和器官中廣泛表達，如卵巢、皮膚和骨骼肌[5-6]，FST是卵巢顆粒細胞的特異性基因之一，已被確定為小鼠早孕建立所必需的基因，可能在卵泡發生及黃體形成過程中起作用[7-10]。Qin等[11]通過對雞卵泡發育過程的研究表明FOXL2與激活素A、GDF9或FST共同參與FSHRmRNA表達和顆粒細胞增殖的復雜機制。另外，Wasti等[12]發現，FST在蛋雞子宮組織的腔和腺上皮中表達，且對蛋殼礦化產生影響。FST序列已經在綿羊、豬、馬及魚中被克隆，并利用表達載體研究了其功能。何新等[13]克隆了豬FSTcDNA，獲得了完整的豬FSTcDNA編碼序列，獲得63 ku的蛋白表達載體，并表明其在大腸桿菌中以谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白的形式表達卵泡抑素蛋白。Pang等[14]克隆了鰱魚的FST基因(HynFST)，并進行了序列分析，發現HynFSTcDNA含有一個2 134 bp的ORF片段，編碼349個氨基酸，HynFST在大多數發育階段和各種組織中均有表達，并在卵巢表達水平最高。Yang等[15]克隆并分析了大黃魚FST基因5′側翼區的部分序列。Ni等[16]克隆了葡萄牙牡蠣FST的全長cDNA，共1 297 bp，編碼241個氨基酸，證明FST可能通過自分泌信號在牡蠣卵巢發育中發揮重要作用。張寧等[17]從綿羊卵巢RNA中擴增出1 038 bp的FST全長cDNA序列，并通過SDS-PAGE和Western blotting檢測到66 ku的FSTcDNA表達產物。另外，有研究人員從馬卵巢cDNA文庫中分離到編碼馬FST的cDNA克隆，表明FST在馬不同組織中均有表達，且對維持妊娠有重要作用[18]。雖已證明FST在多種生物的不同組織器官中發揮作用，更是卵巢發育所必須的基因[19]，然而，目前尚沒有關于雞FST基因序列信息和功能的研究報道。

太行雞是河北省首個通過國家畜禽遺傳資源委員會認定的地方品種，蛋肉品質優良，但產蛋量較低。本試驗以太行雞為研究對象，克隆FST基因序列，運用生物信息學軟件預測基因功能，并在此基礎上通過實時熒光定量PCR技術研究該基因在各個組織及不同發育階段卵泡的表達水平，以期為進一步探究FST基因的調控功能、改善地方品種太行雞的產蛋性能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物選自河北天凱食品有限責任公司太行雞保種基地，選用相同的飼糧水平和飼養條件下進行單籠飼養的43周齡麻羽太行母雞。

1.2 試劑

PCR反應相關試劑、反轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒均由江蘇諾唯贊生物科技股份有限公司生產，pMD19-T Vector 由TaKaRa Bio公司生產，RNA提取試劑盒由北京艾德萊生物科技有限公司生產，氨芐青霉素由北京索萊寶科技有限公司生產，大腸桿菌DH5α感受態細胞由上海生工生物工程(上海)股份有限公司生產，質粒小提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計合成 根據NCBI 網站原雞(Gallusgallus)FST基因(NM_205200.1)的CDS序列，用Primer Primer 5.0軟件設計編碼區擴增引物。上游引物P1-F：5′-ATGTTAAATCAGAGGATCCACCC-3′；下游引物 P1-R：5′-ACCACTCTAGAATGGAAGATATAGGA-3′。引物由上海生工生物股份有限公司合成。熒光定量PCR引物P2-F: 5′-CTTATCCGAGCGAGTGTGCCATG-3′; P2-R: 5′-TCCTCTTCTTCCTCTGGGTCTTCG-3′，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.2 組織總RNA的提取及cDNA合成 選擇5只健康的太行雞(43周齡)，頸靜脈采血，在屠宰后快速采集心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢樣品，參照郭曉莉[20]文中所述，分離卵巢中小白卵泡(small white follicles, SWF,直徑<3 mm)、大白卵泡(large white follicles, LWF, 直徑3～5 mm)、小黃卵泡(small yellow follicles, SYF, 直徑6～8 mm)和大黃卵泡(large yellow follicles, LYF, 直徑9～12 mm)及等級卵泡：F6、F5、F4、F3、F2和F1卵泡。將采集到的所有組織用液氮冷凍后，置于-80 ℃保存，備用。

采用RNA提取試劑盒提取所采集太行雞組織的總RNA，提取完成后使用超微量分光光度計及凝膠電泳技術檢測RNA的濃度及完整性，利用HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康為世紀，中國)將得到的總RNA進行反轉錄，合成cDNA 第一鏈。反轉錄總體系為 20 μL：RNA模板1 μL，10×gDNA Eraser Buffer 1 μL，gDNA Eraser 0.5 μL，DEPC-ddH2O 12.5 μL，5×Script RT Buffer 4 μL，HiFi Script(200 U·μL-1)0.5 μL，Primer Mix(10 μmol·L-1)0.5 μL。反應程序：42 ℃ 孵育15 min，85 ℃ 滅活5 min。將cDNA模板放到-20 ℃冰箱保存，備用。

1.3.3FST基因PCR擴增、克隆測序 以合成的 cDNA 第一鏈為模板，進行PCR擴增。反應體系為：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq Plus Master MixII 10 μL，ddH2O 8 μL。擴增反應程序為：94 ℃預變性 2 min；94 ℃變性30 s，61 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物經過 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產物直接與pMD19-T Vector載體4 ℃恒溫連接過夜，利用熱激法轉至大腸桿菌 DH5α感受態細胞，鋪板挑單克隆培養，根據菌液PCR產物大小驗證載體連接情況，菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果用SeqMan軟件比對拼接，獲得太行雞FST基因完整的CDS序列。

1.3.4FST基因的生物信息學分析FST基因的電子翻譯采用DNAstar軟件的Editseq工具完成。利用NCBI中的ORF Finder程序尋找FST完整開放閱讀框；將測序獲得的太行雞FST基因CDS區的氨基酸序列與日本鵪鶉(NP_001310120.1)、盔珠雞(XP_021236409.1)、虎皮鸚鵡(XP_005152012.1)、獵隼(XP_005443976.1)、黑胸山蜂鳥(NXU70976.1)、大杜鵑(XP_009554129.1)、野鴿(XP_005500938.1)、幾維鳥(XP_025918523.1)、白腰文鳥(XP_021409534.1)、金絲雀(XP_030093406.1)和白喉雀(XP_005490721.1)的FST基因序列進行同源性分析。利用在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對FST蛋白理化性質進行預測，利用Expasy-Protscale軟件預測FST蛋白的親疏水性，使用SignalP 5.0軟件預測FST蛋白的信號肽，采用NetNGlyc 1.0 Server預測FST的N-糖基化位點和O-糖基化位點，用NetPhos 3.1 Server 軟件預測太行雞FST的磷酸化位點；運用在線分析軟件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測其跨膜區結構，利用在線服務器ExPASy中的PSORT Prediction程序進行亞細胞定位預測；利用NCBI CD的CD-Search工具對FST蛋白進行蛋白保守域預測；使用NPSA預測蛋白的二級結構；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)平臺預測蛋白質的三級結構。

1.3.5FST基因實時熒光定量PCR表達分析 以太行雞心、肝、脾、肺、腎、卵巢和肌肉7種組織及不同時期卵泡的cDNA為模板，P2-F/R為引物，GAPDH為內參，采用SYBR Green I 染料法實時熒光定量PCR檢測，對FST基因在不同組織及不同發育時期卵泡中的表達量進行分析。RT-qPCR反應總體系為20 μL：上、下游引物各0.5 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，模板1 μL。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，共40個循環。每個樣品重復3次。反應結束后，分析熔解曲線，檢測引物特異性。

1.4 數據分析

通過2-△△Ct法[21]計算太行雞不同組織中FST基因的相對表達量，以GAPDH為內參，分別以肝和卵巢組織中的表達量為對照，用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型分析不同組織及發育時期卵泡中基因的表達量差異，以P<0.05表示數據差異顯著。

2 結 果

2.1 FST基因的克隆

以cDNA為模板PCR擴增FST基因，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果見圖1。擴增產物條帶單一、清晰，片段大小與預期結果相符。將PCR產物克隆到pMD-19T載體，篩選陽性質粒，菌液PCR驗證，得到片段大小與預期一致(圖2)，測序結果證實其編碼區序列長度為1 032 bp，大小與預期一致。

圖1 太行雞FST基因PCR產物電泳結果

圖2 pMD-19T-FST菌液PCR產物電泳結果

2.2 FST蛋白的生物信息學分析

2.2.1 FST同源性比對分析 序列分析發現，在104～1 135 bp處存在完整開放閱讀框，長為1 032 bp，編碼343個氨基酸。測序結果同NCBI發表的基因序列進行氨基酸同源性比對分析表明，太行雞FST基因與原雞基因(登錄號：NP_990531.1)氨基酸序列同源性為100.0%，與日本鵪鶉FST的同源性為99.7%，與盔珠雞同源性為99.4%，與虎皮鸚鵡和獵隼同源性為98.3%，與黑胸山蜂鳥和大杜鵑同源性為98.0%，野鴿和幾維鳥同源性為97.7%，與白腰文鳥、金絲雀和白喉雀同源性為97.4%(圖3)。

圖3 不同物種間FST基因編碼氨基酸同源性分析

2.2.2 基因系統進化樹的構建 采用NJ(neighor-jioning)法，通過Mega7.0 軟件構建FST蛋白的系統進化樹，設定為Kimura2-parameter model，重復次數1 000次，結果如4圖，太行雞與原雞、日本鵪鶉、盔珠雞先聚在一起，再與幾維鳥聚在一起，然后與大杜鵑聚在一起，再與野鴿聚在一起。表明太行雞與原雞、日本鵪鶉、盔珠雞的親緣關系最接近。

圖4 太行雞FST系統發育樹分析

2.2.3 氨基酸序列理化性質分析 利用在線網站ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)分析太行雞FST蛋白理化性質，蛋白的分子式為C1619H2567N459O520S44，蛋白的分子量為38.192 6 ku，共編碼343個氨基酸，理論等電點為5.59，其中含量較高的氨基酸有Cys(C)(10.50%)、Glu(E)(8.50%)和Lys(K)(8.20%)，含量較少的是His(H)(1.50%)；帶正電荷的殘基總數(精氨酸+賴氨酸)(Arg + Lys)42個，帶負電的殘基總數(天冬氨酸+谷氨酸)(Asp + Glu)48個。半衰期為：在哺乳動物網織紅細胞體外表達為30 h；在酵母體內表達為20 h以上；在大腸桿菌體內表達為10 h以上。其不穩定系數為42.76，證明其為不穩定蛋白。

2.2.4 蛋白疏水性和跨膜結構域分析 親疏水性分析表明，FST蛋白的親水性氨基酸多于疏水性氨基酸。預測FST蛋白的總平均親水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.498，由于GRAVY值的范圍為-2～2，正值表明此蛋白為疏水蛋白，負值表明為親水蛋白，所以FST蛋白為親水蛋白(圖5)。

圖5 太行雞FST蛋白疏水性分析

運用在線分析軟件 TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測其跨膜區結構，顯示該蛋白無跨膜結構(圖6)。

圖6 太行雞FST蛋白跨膜結構預測

2.2.5 蛋白質信號肽和糖基化位點分析 采用在線軟件SignalP 5.0預測FST蛋白潛在的信號肽，其Sec信號肽(Sec/SPI)概率分值為0.995 5(圖7)，表明太行雞FST蛋白存在Sec信號肽。

圖7 太行雞FST蛋白信號肽

FST蛋白N-糖基化位點和O-糖基化位點預測結果顯示，第123和287位氨基酸處存在潛在的N-糖基化位點(圖8)。潛力值分別為0.644 0、0.516 4，均大于閾值0.5。另外，在57、61、65、176、183、199、285、314、327處發現了O-糖基化位點。

圖8 太行雞FST蛋白N-糖基化位點

2.2.6 蛋白質磷酸化位點分析 FST蛋白存在46個潛在的磷酸位點，分別為第21個絲氨酸、15個蘇氨酸和10個酪氨酸磷酸化位點，潛力值均大于0.5(圖9)。

圖9 太行雞FST蛋白磷酸化位點

2.2.7 蛋白質亞細胞定位預測 利用在線服務器 PSORT WWW Server中的PSORT II Prediction程序進行亞細胞定位預測，K/NN預測結果顯示，太行雞FST蛋白主要定位于細胞核(52.2%)，其他定位于線粒體(26.1%)、細胞質(4.3%)、液泡(4.3%)、細胞骨架(4.3%)和細胞外(包括細胞壁)(8.7%)。

2.2.8 蛋白質保守結構域預測 利用在線軟件HMME R預測發現，太行雞FST蛋白在93～116、166～189、243～267 位3處氨基酸片段間均存在1個 卵泡抑素-N-末端結構域樣(FOLN 結構域)，在116～163、190～238、268～315 位3處氨基酸片段間均存在1個Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑結構域(KAZAL_FS 結構域)，預測太行雞FST蛋白與SNN、INHBA、MSTN、BMP4等蛋白質相互作用，結果如圖10所示。

A.FST蛋白保守結構域示意圖；B.預測FST蛋白互作網絡圖

2.2.9 蛋白質二級結構預測 使用在線軟件NPS@:NetworkProteinSequenceAnalysis對太行雞FST蛋白二級結構進行分析(圖11)，56個氨基酸參與α-螺旋，占比為16.33%；57個氨基酸參與氨基酸殘基構成的延伸鏈，占比為16.62%；18個氨基酸參與β轉角，占比為5.25%，212個氨基酸參與無規卷曲，占比為61.81%。由此說明，在太行雞FST蛋白二級結構中，無規卷曲是主要的結構形式。

圖11 太行雞FST蛋白二級結構

2.2.10 蛋白質的三級結構預測 利用在線軟件SWISS-MODEL的自動建模功能，對太行雞FST蛋白三級結構進行預測，三維模型見圖12。用于建立該模型的氨基酸殘基范圍為29～326位，該模型以5jhw.1(Crystal Structure of the GDF11:Follistatin288 complex)蛋白為模板，序列同源性為93.06%。

圖12 太行雞FST蛋白三級結構

2.3 太行雞FST基因在不同組織和發育時期的表達

2.3.1FST基因在不同組織中的表達 如圖13所示，FST基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉及卵巢中均有表達，且在各組織中的表達量存在顯著差異(P<0.05)。FST在肝中表達最豐富，其次是脾、肺和腎，在心、卵巢和胸肌表達水平較低。統計分析表明，FST基因在肝與脾組織中表達量無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于卵巢、心、肺、腎和胸肌(P<0.05)。

相同字母表示無顯著性差異(P>0.05)，不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)，下同

2.3.2FST基因在不同發育階段卵泡中的表達FST基因在卵巢中的表達量較低，卵泡發育至大白卵泡(3～5 mm)過程中呈上升趨勢，并達到峰值；之后呈現下降趨勢，在小黃卵泡(6～8 mm)向大黃卵泡(9～12 mm)發育過程中表達量明顯減少，并存在1.6倍差異(小黃卵泡平均差異倍數：22.03；大黃卵泡平均差異倍數：13.75)。在F5卵泡中小幅度升高后，在F4～F1發育過程中一直維持在相對較低的水平。統計分析表明，FST基因在大白卵泡中的表達量顯著高于其它發育時期卵泡(P<0.05)；另外，該基因在卵泡選擇前的小黃卵泡中表達水平與F3～F1階段存在顯著差異(P<0.05)(圖14)。

SWF.小白卵泡；LWF.大白卵泡；SYF.小黃卵泡；LYF.大黃卵泡。等級卵泡由小到大依次為F6～F1表示

3 討 論

太行雞是國家畜禽遺傳資源委員會審定的第一個河北省地方家禽品種。其雞蛋品質好，耐粗飼[22]，但產蛋性能低，500天產蛋數為160～180枚，影響規?；B殖效益，故在育種中著重研究如何提高其產蛋性能具有重要理論和現實意義。本試驗以太行雞為研究對象，成功獲得FST基因外顯子克隆拼接后的完整CDS區序列，對該序列結構特征進行生物信息學分析，得到FST基因CDS區片段長度1 032 bp，編碼343個氨基酸，該結果與Connolly等[23]在雛雞中的研究結果相同，另外，劉賀賀等[24]在鴨中同樣克隆出1 032 bpFST基因CDS區，但與其它物種該基因開放閱讀框并不相同。通過構建系統發育樹及同源性分析，表明太行雞FST基因與日本鵪鶉和盔珠雞的同源性較高(>99%)，與野鴿等其他鳥類同源性在95%以內，說明該基因在鳥類中高度保守，可能發揮相似的功能。

Jiao等[25]和Luo等[26]通過免疫組織化學分析證實了豬的骨骼肌、脂肪組織、心肌、肝、脾、肺和腎中均有FST基因表達。這與本研究相似，本試驗證明，FST基因在太行雞各組織中均有表達，其中在肝、脾、腎中高表達。已有研究顯示，FST可誘導完整的肝細胞增殖[27]，FST體外和體內試驗均顯示，該基因可獨立于其激活素發揮中和作用，通過中和活性氧和抑制氧化應激來保護TG誘導的細胞凋亡[28]。雖然本試驗中FST基因在心和肌肉中的表達量不高，但大量研究顯示，該基因在心及肌肉組織中發揮著重要作用，Van Den Berg等[29]指出，FST在發育中瓣膜上覆蓋的心內膜高度定位表達，表明其在瓣膜形成中發揮作用。此外，FST在肌肉發生過程中發揮重要作用[30]。過表達FST的轉基因虹鱒魚表現出肌肉發達的現象[31]，更有研究指出，FST有可能成為促進農業動物骨骼肌生長和治療人類骨骼肌萎縮性疾病的潛在藥物[32]，但是本研究中FST在肌肉中的表達量不高，這可能是由于物種間的差異，也可能是由于所選時期不是肌肉發育高峰期造成的。

雖然FST基因在太行雞卵巢組織中表達量較低，但其在卵巢中發揮的重要作用不容忽視。目前的研究表明，在成年卵巢中，垂體FSH通過與其受體(FSHR)相互作用是卵泡發育、顆粒細胞增殖和分化所必需的[33-34]。Xu等[35]對牦牛在非繁殖季節卵巢組織中FST的表達分析顯示，其表達量顯著降低(P<0.05)；Li等[36]研究了FST在促進豬早期胚胎發育中的作用，發現不同FST亞型產生效果并不相同，FST-300可以促進初始卵裂時間并提高胚泡形成率，而FST-315可以提高胚泡質量。FST是卵泡發育中不同階段卵泡分化的關鍵介質之一；可通過調節FSH的分泌和嚙齒動物性腺的活動、雄激素的產生和妊娠，在生殖過程中發揮作用[37]。鑒于FST基因在卵泡發育過程中的重要作用，本研究對太行雞不同發育時期卵泡中FST的表達進行研究，結果顯示，在大白卵泡(LWF)中表達量最高，且在卵泡選擇前后的小黃卵泡、大黃卵泡中表達量有1.6倍的差異。Qin等[38]在馬崗鵝中的研究提到，血液中抑制素和卵泡抑素的持續存在可能會抑制馬崗鵝產蛋后新的SYF重新進入排卵前的LYF發育。此外，在產卵過程中，一些大量存在于血液循環中的激素，由于抑制素和FST抵消了激活素從而促進小卵泡發育[39]。Moros-Nicols等[40]研究顯示，FST在豬小卵泡(<3 mm)的卵母細胞和周圍卵丘細胞(CCS)的轉錄豐度高于中等卵泡(3～6 mm)CCS；但Costermans等[41]提出，FST在不同大小直徑卵泡的CCS中轉錄豐度無顯著差異。Owens等[42]發現，FST在人小竇卵泡顆粒細胞(GC)表達量顯著高于大的黃素化卵泡GC；Xia等[43]研究發現，在布氏母羊黃體晚期卵泡液和卵巢血中FST濃度升高，表明FST對現有功能黃體的黃體溶解和新卵泡隊列的發育具有雙重作用。有趣的是，在雌激素激活的牛卵泡顆粒細胞大卵泡中，FST基因互作網絡上MSTN的mRNA在顆粒細胞(GC)中的表達最低，而GCFST在這一階段的表達最高[44]。本研究顯示，太行雞FST在3～5 mm卵泡中表達量最高，且在F3～F1這一時期卵泡中穩定表達，與Qin等[11]在雞上的研究結果基本一致，他們的研究顯示，雞FSTmRNA在4～8 mm和9～12 mm卵泡中表達水平最高。但是，Lovell等[39]在蛋雞上的研究顯示，在4～5 mm卵泡的G層未檢測到FST，而在5～6 mm 的卵泡中可檢測到FST，G層FST含量在小幅升高后下降，并一直維持在這一相對較低的水平至F1。通過免疫組織化學方法研究FST在大鼠組織中的定位發現，FST的表達強度隨著卵泡的發育而變化，FST的表達在排卵前卵泡的發育過程中起重要作用，但在排卵后它的表達會降低，從而形成黃體[45]。本研究得到的結果與前人結果部分一致，驗證了FST基因在太行雞不同發育時期卵泡中的表達差異，推測該基因在太行雞產蛋過程中發揮著重要作用，進一步證明該基因對提高太行雞產蛋量有調控作用，是研究太行雞繁殖性能的重要候選基因之一。

4 結 論

太行雞FST基因CDS序列全長1 032 bp，共編碼343個氨基酸，該基因在禽類中高度保守。FST基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢等組織中均有表達，且在肝中表達量最高。卵泡選擇過程中FST表達存在1.6倍差異，表明該基因是雞產蛋量的重要候選基因，對繁殖性能的選育提高有積極作用。