鴨甲型肝炎病毒1型與3型雙重TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

林夢舟，吳 雙，徐建生，謝 軍，吳 植，姜 勇，朱善元*

(1.揚州大學獸醫學院，揚州 225009；2.江蘇農牧科技職業學院 江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，泰州 225300；3.江蘇立華牧業股份有限公司，常州 213000)

近年來，隨著中國水禽養殖產業的快速發展，鴨常見的傳染性疾病不斷增多[1]，導致鴨病的發病率和死亡率居高不下，給臨床檢測和防控帶來了困擾，嚴重影響了水禽產業的健康發展，帶來了巨大經濟損失[2]。

鴨病毒性肝炎(duck viral hepatitis，DVH)是由鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis virus A，DHAV)引起的一種急性、高度接觸性的病毒性傳染病[3]，主要侵害4周齡以內的雛鴨，剖檢時典型特征為肝腫大并帶有出血點[4]，可通過消化道和呼吸道感染[5]。DHAV分為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3三種不同的基因型[6]。2010年以前，國內發病以DHAV-1型為主，2013年以后DHAV-3發病率明顯高于DHAV-1[7]；同時也存在混合感染的現象[8]，二者的臨床癥狀相似，僅憑剖檢病變難以進行鑒別診斷[9-10]。

實時熒光定量PCR方法具有快速、高效、敏感性高、特異性強等特點[11]，本研究中建立的DHAV-1和DHAV-3雙重TaqMan熒光定量PCR方法不僅能高效檢測混合感染情況，還可以準確測定動物組織的病毒載量。臨床疑似樣品的檢測結果表明，該方法適合臨床推廣、可適用于大規模樣品檢測。

1 材料與方法

1.1 病原和SPF雛鴨

DHAV-1、DHAV-3、新型鴨呼腸孤病毒(NDRV)、番鴨呼腸孤病毒(MDRV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、鴨腺病毒3型(DAdV-3)、新城疫病毒(NDV)、鴨細小病毒(DPV)、H9N2亞型禽流感病毒(H9N2-AIV)、鴨圓環病毒(DuCV)，其中NDV基因來源為新城疫Ⅳ系活疫苗(LaSota)，其余均由江蘇省生物制藥高技術研究重點實驗室鑒定、分離和保存。SPF種鴨蛋購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司，由本實驗室自行孵化至10日齡或出雛，SPF雛鴨轉移至隔離器飼養。

1.2 主要試劑

FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Viral RNA/DNA Kit DNA/RNA提取試劑盒購自CWBIO，TE引物稀釋液、DNA稀釋液(熒光定量專用)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，DNA 酶(TaKaRaTaqversion 2.0 plus dye)、Premix ExTaq(Probe qPCR)、Premix Taq PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒、E.coliDH5α均購自寶生物工程(大連)有限公司，克隆載體pGEM?T-easy 購自Promega 公司，2000 bp DNA marker、50 bp DNA marker均購自Solarbio，FastPrep-24TM5G 高速勻漿儀購自美國MP公司，Veriti PCR儀和 QuantStudio 3 Real-time PCR System 均購自美國應用生物系統公司(Applied biosystems)。

1.3 引物的設計及合成

從NCBI/GenBank上下載DHAV-1(89株)和DHAV-3(35株)的基因序列，經過BioEdit軟件分析，使用Gene Runner 和Primer Express軟件分別針對保守的VP1序列設計一對特異性標準品引物(表1)和一對特異性熒光定量PCR引物與探針(表2)，BLAST結果表明引物和探針具有良好特異性，引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 標準品引物序列

表2 熒光定量PCR引物及探針序列

1.4 核酸提取及反轉錄

剪取常規PCR方法鑒定的DHAV-1、DHAV-3陽性病料，與PBS按1∶9加入到2 mL研磨管中，使用FastPrep-24TM5G勻漿機將樣品勻漿，經過10 min高速(10 000 g·min-1)離心后，吸出上清。參照Viral RNA/DNA Kit DNA/RNA提取試劑盒、PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒說明書，對DHAV-1、DHAV-3、NDRV、MDRV、DTMUV、DAdV-3、NDV、DPV、H9N2-AIV、DuCV進行核酸提取與反轉錄。

1.5 重組質粒標準品的制備

以提取的DHAV-1、DHAV-3基因組為模板分別進行VP1基因的PCR擴增，體系：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各2 μL、模板2 μL，無核酸酶的滅菌水補至終體積50 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35個循環；72 ℃終延伸 5 min;-4 ℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后切下與預期大小一致(DHAV-1為257 bp、DHAV-3為274 bp)的目的條帶，參照FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit 凝膠回收試劑盒說明書進行回收，得到目的片段后與 pGEM?T-easy 載體連接，再轉化至E.coliDH5α感受態細胞中。涂布菌液于AIX板進行藍白斑篩選，挑取白斑進行搖菌，經菌液PCR鑒定及酶切鑒定正確的菌液送南京擎科生物科技有限公司測序。參照FastPure Plasmid Mini Kit 質粒提取試劑盒說明書提取質粒，用微量蛋白核酸定量儀測定質粒濃度，重組質粒拷貝數由下式計算[12]：

質粒拷貝數=(6.02×1023)×(質粒含量×10-9)/(質粒長度×660)

將DHAV-1與DHAV-3的質粒分別稀釋至2×109copies·μL-1后，合并為1×109copies·μL-1的混合質粒，再作10倍梯度稀釋，制備得109～101copies·μL-1的標準質粒。

1.6 雙重 TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立及優化

1.6.1 反應條件的優化 通過調整引物濃度、探針濃度和退火溫度，摸索雙重q-PCR的最優反應體系與反應條件，陰性判定標準為無S型擴增且無Ct值。

1.6.2 標準曲線的建立 將測序正確的質粒按拷貝數進行梯度稀釋，在建立DHAV-1和DHAV-3單重q-PCR檢測方法的基礎上建立了DHAV-1和DHAV-3雙重q-PCR標準曲線。

1.6.3 特異性試驗 分別取 NDRV、MDRV、DTMUV、DAdV-3、NDV、DPV、H9N2-AIV、DuCV的DNA或RNA按照相同條件代替DHAV-1與DHAV-3進行q-PCR檢測，滅菌超純水為陰性對照，以驗證其特異性。

1.6.4 敏感性試驗

1.6.4.1 檢測陽性質粒的敏感性：將上述10倍梯度稀釋(105～101copies·μL-1)的標準品作為擴增模板進行q-PCR，確定其敏感性。

1.6.4.2 檢測病料的敏感性：提取新鮮病料的RNA并反轉錄，按已建立的標準曲線進行定量。確定拷貝數后10倍梯度稀釋，用作模板驗證敏感性。

1.6.5 重復性試驗 使用106～104copies·μL-1的標準質粒來確定其重復性，組間及組內變異系數均進行3次重復。

1.7 動物試驗組織樣品檢測

為了初步驗證臨床疑似樣品的檢出率，利用q-PCR 方法分別鑒定出僅含有DHAV-1或DHAV-3的2份陽性病料，取出這2份陽性病料進行研磨、離心，將上清過濾后經尿囊腔接種10日齡SPF鴨胚，收取尿囊液傳代5次。分別取第5代次尿囊液按照103ELD50的量經腿部肌內注射接種7日齡SPF雛鴨，設置PBS對照組，劑量均為0.2 mL·只-1，每組各3只。48 h后剖解，取其心、腦、脾、肝。核酸提取與反轉錄方法同“1.4”。利用已建立的雙重定量方法對各器官內的病毒進行定量檢測。

1.8 臨床樣品檢測

選取2017—2019年來自蘇中、蘇北地區規模化養鴨場的40份疑似感染鴨肝炎病毒的組織樣品，處理方法同“1.7”，使用相同的DHAV1-105與DHAV3-94引物，應用建立的q-PCR 方法與常規 PCR 方法分別進行檢測，比較兩種方法的陽性率(陽性數/總檢測數)。

2 結 果

2.1 雙重q-PCR反應條件的優化

將引物和探針分別稀釋至10 μmol·L-1，使用矩陣法尋找最優引物用量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL)、探針用量(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL)和退火溫度(57、58、59、60、61和 62 ℃)。DHAV-1反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 31 s，共40次循環；DHAV-3優化后退火溫度為61 ℃，其余條件與DHAV-1一致。在此單重檢測方法的基礎上，優化引物、探針濃度和退火溫度后，得到雙重q-PCR反應體系: 12.5 μL 2×Premix ExTaq(Probe qPCR)，0.5 μL 50×ROX Reference Dye，DHAV-1與DHAV-3上下游引物各0.6 μL，探針分別為0.8與0.5 μL，1.0 μL DNA模板，滅菌超純水分別為9.0和9.3 μL。退火溫度為60 ℃。

2.2 標準曲線的繪制

DHAV-1與DHAV-3分別選擇FAM和VIC為熒光基團。使用濃度為1×108～1×103copies·μL-1的標準質粒作為模板，按照已優化的反應條件進行q-PCR檢測，以拷貝數的對數為橫坐標，Ct值為縱坐標建立標準曲線(圖1)，其中，DHAV1-VP1的線性關系表達式為Y1=-3.116X+42.385，R2=1，E= 109.36%；DHAV3-VP1的線性關系表達式為Y2=-3.147X+41.366，R2=0.999，E=107.876%。擴增效率和相關系數良好，說明建立的標準曲線具有可靠性。

A.DHAV-3；B.DHAV-1

2.3 雙重q-PCR的特異性

應用本研究建立的雙重TaqMan熒光定量PCR方法對DHAV-1、DHAV-3、NDRV、MDRV、DTMUV、DAdV-3、NDV、DPV、H9N2-AIV和DuCV的基因組進行檢測，結果(圖2)顯示，DHAV-1和DHAV-3出現S型擴增曲線，為陽性擴增，其他病毒和陰性對照均為陰性擴增，表明該檢測方法特異性優良。

A.DHAV-3；B.DHAV-1；C.陰性對照及其他病毒

2.4 雙重q-PCR的檢測敏感性

2.4.1 標準品PCR檢測的敏感性 采用本研究已經建立的檢測方法，將105～101copies·μL-1的標準品作為擴增模板分別進行常規PCR檢測與q-PCR檢測，結果如圖3和圖4a，DHAV-1與DHAV-3的常規PCR檢測靈敏度分別為104、103copies·μL-1，q-PCR 檢測靈敏度均為10 copies·μL-1，比較兩種方法的結果，可見使用雙重TaqMan熒光定量PCR檢測方法比常規PCR檢測方法的靈敏度分別提升了1 000倍和100倍，表明本研究建立的檢測方法可大大提高最低檢測限。

圖3 DHAV-1(左)與DHAV-3(右)常規PCR靈敏度(標準品)

2.4.2 病料PCR檢測的敏感性 將DHAV-1與DHAV-3的cDNA按已建立的標準曲線進行定量，并分別稀釋至2×105后混合，再進行10倍梯度稀釋得到105～101copies·μL-1的病料標準品。以病料標準品為模板進行q-PCR檢測，結果(圖4b)與質粒標準品一致，說明本方法可以運用于臨床檢測。

a.標準品(105～101 copies·L-1)；b.組織病料(105～101 copies·L-1)；A.DHAV-3；B.DHAV-1

2.5 雙重q-PCR的重復性

以106～104copies·μL-1的標準質粒為模板，同一批次做三個重復驗證組內變異系數，做三個批次驗證組間變異系數，結果表明，DHAV-1、DHAV-3的組內變異系數均小于0.76%，組間變異系數均小于0.61%，說明建立的雙重TaqMan熒光定量PCR檢測方法有良好的重復性。

2.6 動物試驗組織樣品檢測

攻毒后24～48 h雛鴨均出現明顯角弓反張，并且很快死亡，剖解后取心、腦、脾和肝等臟器組織，用已建立的雙重q-PCR方法分別對DHAV-1與DHAV-3攻毒組鴨心、腦、脾、肝進行定量檢測，檢測結果如圖5，DHAV-1與DHAV-3感染病鴨的各器官內均含有病毒，肝和脾內病毒含量最高，DHAV-1感染量達到(7.0～7.3)×105copies·mg-1，DHAV-3感染量達到(2.5～2.6)×107copies·mg-1。

圖5 DHAV-1與DHAV-3攻毒組各器官病毒含量

2.7 臨床樣品檢測

應用本研究中建立的雙重Taqman熒光定量PCR檢測方法對來自蘇中、蘇北地區的疑似患病鴨的心、腦、脾、肝等臨床樣品進行檢測，并與常規PCR檢測結果進行對比。結果顯示，q-PCR的DHAV-1陽性率為37.5%(15/40)，DHAV-3陽性率為60%(24/40)，其中混合感染的陽性率為7.5%(3/40)，總陽性率為90%(36/40)；常規PCR方法的DHAV-1陽性率為20%(8/40)，DHAV-3的陽性率為52.5%(21/40)，總陽性檢出率為(72.5%)。其中，q-PCR檢測中高Ct值(>35)的樣品使用常規PCR方法并不能檢出。臨床檢測結果顯示，鴨肝炎病毒的感染情況復雜，存在混合感染的現象，并且常規PCR的檢測無法實現對病毒篩查的全面覆蓋，因此建立靈敏、高度特異的雙重檢測方法尤為重要。

3 討 論

DHAV屬于小 RNA 病毒科，DHAV-1與DHAV-3是國內流行的兩種基因型[13]，具有相同的基因組結構[14]，大小約為7.7 kb[15]。其基因組主要由5′端非編碼區、開放閱讀框、3′端非編碼區和Poly(A)尾巴構成[16]。整個開放閱讀框編碼三種成熟的結構蛋白(VP0、VP1和VP3)和9種非結構蛋白(A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D)[17]。

近年來，隨著養殖業的不斷發展，鴨養殖量不斷增加，一旦暴發鴨病毒性肝炎，就會導致大量雛鴨死亡，造成巨大的經濟損失。在我國，同時存在DHAV-1和DHAV-3的流行，但由于這兩種病原引起的雛鴨發病癥狀和病理變化都非常相似，在臨床上難以區分[18]。此外，由于抗原性不同，經中和試驗和熒光抗體試驗證實，DHAV-1與DHAV-3不能形成交叉保護[19]，實際情況下DHAV-1疫苗不能避免雛鴨感染DHAV-3。及時確診DHAV的發生和流行，并評估當前的流行趨勢，有助于最大程度地減少損失。因此，建立針對該疾病的高效、精確、靈敏和特異的檢測方法十分重要，有助于確定病原的類型，并且對疾病的預防、治療和控制有重大意義。

目前，PCR是用于DHAV檢測的首選方法。但是，傳統的PCR測試需要多個步驟，耗時較長，而且假陽性率高、特異性差。q-PCR與傳統PCR相比更具優勢，可同時兼顧定性與定量[20]，并且時間成本更低，更適用于樣品的大規模檢測。在已報道的研究中，劉海燕等[21]建立的一種針對DHAV-1的單一q-PCR 檢測方法，檢測靈敏度為20 copies·μL-1；胡琴等[22]開發了用于DHAV-3的q-PCR檢測方法，檢測限為10 copies·reaction-1。試驗結果表明,本研究建立的雙重q-PCR檢測方法同樣具有單一q-PCR 檢測方法的快速、特異、靈敏等優點。

為了評估該方法，對7日齡雛鴨進行了攻毒試驗，以及對2017—2019年間來自蘇中、蘇北地區的40份疑似鴨肝炎病毒感染的樣品進行檢測。動物試驗中組織樣品檢測結果顯示，DHAV-1與DHAV-3感染病鴨的肝和脾中病毒含量明顯高于其他臟器，分別可達到(7.0～7.3)×105copies·mg-1和(2.5～2.6)×107copies·mg-1。臨床樣品檢測結果顯示，DHAV-1、DHAV-3和混合感染的陽性檢出率分別為37.5%、60%和7.5%。以上結果驗證了本研究中所建立方法的準確性、靈敏性、重復性及可靠性。

4 結 論

本研究中建立的DHAV-1與DHAV-3 雙重TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法在103～108copies·μL-1內建立了標準曲線且線性關系良好；DHAV-1與DHAV-3的檢測靈敏度均可達到10 copies·μL-1；證明建立的檢測方法檢測范圍廣，靈敏度高及特異性優良。該雙重q-PCR檢測方法可作為一種診斷和檢測DHAV-1、DHAV-3及其混合感染的可靠工具，有助于對鴨肝炎病毒進行分子流行病學研究。