短管兔耳草多糖的結構表征及其免疫調節活性研究

余蕊宏，孟 禎，孫夢珂，陳仕雄，張浚文，黃一帆，秦 韜，任 喆

(福建農林大學動物科學學院 福建省獸醫中藥與動物保健重點實驗室，福州 350002)

短管兔耳草(LagotisbrevitubaMaxim)又名“洪連”，屬玄參科(Scrophulariaceae)短管兔耳草屬(LagotisGaertn)草本植物[1]，主要分布于我國西藏、青海、甘肅等[2]地區。作為民間傳統藏藥，短管兔耳草在治療全身發熱、肺病、腎炎、高血壓等[3]疾病中具有良好的療效。大量藥理研究和臨床實踐表明，短管兔耳草主要含有苯丙素苷類、酚類、環烯迷萜苷類和黃酮類等化學成分，這些成分具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、免疫調節等[4-6]作用。多糖(polysaccharide)作為短管兔耳草中的活性成分之一，是一類具有多種生物活性的天然大分子物質，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調節活性等[7-9]。多糖作為一種天然的免疫調節劑，具有毒副作用小、安全性較高等[10]特點，已成為近年來研究的一大熱點。

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是一種重要的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cells，APC)，在機體細胞免疫和體液免疫調控中具有重要作用[11]。未成熟的DC受到抗原刺激后變為成熟的DC，遷移至淋巴器官后，通過主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)分子提呈抗原多肽和共刺激分子來激活T細胞，從而啟動特異性免疫應答[12-13]。研究表明[14]，多糖可通過與DC表面的多種受體結合，激活不同的信號通路，從而誘導DC表型和功能的成熟，最終對機體起到免疫調節作用。目前，國內外關于短管兔耳草的報道只局限于其化學組成和提取工藝方面[15-17]，尚未見有關短管兔耳草多糖(LagotisbrevitubaMaxim polysaccharide，LMP)的結構和免疫調節活性的報道。

因此，本試驗從短管兔耳草中分離純化得到成分均一的多糖LMP，通過高效凝膠色譜法(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)、傅里葉變換-紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)、紫外光譜(ultraviolet spectroscopy)、掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)、原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)等方法對其結構進行分析，并進一步評價其對BMDCs的免疫調節活性，以期為短管兔耳草多糖的開發和利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

ICR雄性小鼠，6～8周齡，購于福州吳氏動物公司；短管兔耳草購自福州晴百旺公司；DEAE-52纖維素購于Whatman公司；蛋白含量檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；RPMI 1640培養液、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；PBS、噻唑藍(MTT)、紅細胞裂解液、青霉素-鏈霉素購于Solarbio公司；anti-mouse CD16/CD32封閉抗體購自杭州聯科生物公司；流式抗體anti-mouse FITC-CD80、CD86、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ均購自eBioscience公司；絲裂霉素C購自合肥博美生物科技公司；脂多糖(LPS)、FITC-dextran購自Sigma公司；rm GM-CSF與rm IL-4均購自深圳欣博盛生物科技公司；小鼠TNF-α、IL-12試劑盒購自上海酶聯生物科技公司；其余試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑公司。

1.2 主要儀器

ABT 320-4M電子天平系德國科恩公司產品；真空冷凍干燥機購自德國CHRiST公司；傅里葉紅外光譜儀系美國Thermo公司產品；RE-52CS旋轉蒸發儀系上海亞榮生化儀器廠產品；Nano Plus3激光粒度儀購自Malvern公司；MultiMode 8 SPM原子力顯微鏡系Bruker公司產品；臺式高速離心機購自美國BECKMAN公司；NovoCyte流式細胞儀購自艾森生物有限公司；Infinite M200 Pro酶標儀購自TECAN公司；二氧化碳恒溫培養箱購自西德Haraneus公司。

1.3 短管兔耳草多糖的分離和純化

1.3.1 短管兔耳草多糖的提取 稱取干燥的短管兔耳草500 g，置于3倍體積的95%乙醇中浸煮3 h，用以除去脂溶性物質。脫脂后的短管兔耳草按1∶20的固液比加入雙蒸水，置于恒溫電熱套(110 ℃)中浸煮2 h。8 000 r·min-1離心10 min后，合并所有的上清液，經減壓濃縮至原體積的1/3，再次加入95%乙醇進行醇沉，靜置過夜。8 000 r·min-1離心10 min 后，收集沉淀，經冷凍干燥后得到短管兔耳草粗多糖。

1.3.2 除蛋白 采用Sevage液(正丁醇∶氯仿=1∶5)除去短管兔耳草粗多糖的蛋白，Sevage液與粗多糖溶液的比例為1∶5。重復上述步驟3～4次 后，合并所有的上清液，經濃縮、醇沉、離心后，收集沉淀，經冷凍干燥后得到除蛋白后的短管兔耳草粗多糖。

1.3.3 DEAE-52纖維素柱層析 采用DEAE-52纖維素柱層析法對短管兔耳草粗多糖進一步分離純化，上樣濃度為100 mg·mL-1，上樣體積為10 mL，流速為1 mL·min-1，洗脫液為雙蒸水。利用自動收集器收集洗脫液，每管收集5 min，并以苯酚-硫酸法測定每管洗脫液在490 nm處的吸光值，以管數為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制洗脫曲線圖。分別合并收集含多糖的洗脫液，減壓濃縮后靜水透析24 h(分子截留量為100～500 u)，期間每12 h 換水1次。將透析后的溶液進行濃縮，冷凍干燥后即得短管兔耳草多糖(LMP)。

1.3.4 短管兔耳草的化學組成測定 采用苯酚-硫酸法在490 nm處測定LMP的糖含量，采用考馬斯亮藍法在595 nm處測定LMP的蛋白含量，采用鱟試劑法在545 nm處檢測LMP中的內毒素含量。

1.4 短管兔耳草多糖的結構分析

1.4.1 平均分子量測定 將濃度為1 mg·mL-1的LMP溶液，采用HPGPC測定其平均分子量。色譜條件：檢測器為安捷倫1260 Infinity液相色譜儀，配RID-1A示差折光檢測器；色譜柱選用KS-805、KS-804和KS-802三根串聯；流動相為雙蒸水；流速為1 mL·min-1；柱溫為70 ℃，檢測器溫度為50 ℃。

1.4.2 紅外光譜分析 精密稱取2 mg LMP，與200 mg KBr粉末混勻后，于瑪瑙研缽中研磨成極細粉末，壓片后用傅里葉紅外光譜儀在4 000～500 cm-1進行掃描，并記錄紅外光譜。

1.4.3 紫外光譜分析 將LMP配制成0.5 mg·mL-1的多糖溶液，使用紫外分光光度計在200～800 nm測定多糖溶液的紫外吸收光譜。

1.4.4 粒徑和Zeta電位 采用激光粒度儀測定LMP的平均粒徑與Zeta電位，樣品的濃度為0.1 mg·mL-1，測定溫度為25 ℃。

1.4.5 掃描電鏡分析 將少量LMP粉末均勻涂抹于導電膠表面，經噴金處理后，通過掃描電鏡對LMP的微觀結構進行觀察。

1.4.6 原子力電鏡分析 配制10 μg·mL-1的LMP溶液，經磁力攪拌1 h后，用滴管滴加1滴在云母表面，待其干燥后用原子力電鏡在Tapping模式下成像，并對其形態和空間結構進行觀察。

1.5 短管兔耳草多糖的體外免疫活性分析

1.5.1 小鼠骨髓源樹突狀細胞的體外誘導培養 取6～8周齡的ICR雄性小鼠，以頸椎脫臼法處死后，置于裝有75%酒精的容器中。無菌取出股骨和脛骨，用紗布去除附著的肌肉和結締組織后，剪掉骨的兩端，用1 mL無菌注射器吸取PBS，反復沖洗骨髓腔，直到骨髓腔發白。收集細胞懸液，1 500 r·min-1離心10 min后棄上清。收集細胞沉淀，按1∶5體積加入紅細胞裂解液，于冰上裂解2 min。加入RPMI 1640基礎培養液終止反應，1 500 r·min-1離心10 min，棄上清。收集細胞沉淀，加入含20 ng·mL-1rm IL-4和20 ng·mL-1rm GM-CSF的RPMI 1640完全培養液(含10% FBS和1%青-鏈霉素)，將細胞濃度調整為1×106cell·mL-1后接種于6孔板中，每孔4 mL，于37 ℃、5%CO2條件下培養6 d，隔天半量換液并補充刺激因子，培養期間用倒置顯微鏡觀察細胞的形態變化。第7天，棄上清后獲得BMDCs，用RPMI 1640完全培養液重懸，用于后續試驗。

1.5.2 細胞增殖活性 采用MTT法檢測LMP對BMDCs的增殖活性。將培養至第7天的BMDCs，用RPMI 1640完全培養液調整細胞的濃度為1×105cell·mL-1，加入96孔板中，每孔100 μL。37 ℃，5% CO2環境下培養24 h后，每孔加入100 μL 含LMP的RPMI 1640完全培養液(終濃度分別為0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、400.00、800.00 μg·mL-1)，另設空白對照組。24 h后，每孔加入10 μL MTT(5 mg·mL-1)，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后，將96孔板于酶標儀570 nm處測定吸光度值，并以空白組的細胞活力為100%來分析各組的細胞活力。

1.5.3 試驗分組 根據“1.5.2”中BMDCs增殖的試驗結果，分為4組：Control組(RPMI 1640)、LPS組(1 μg·mL-1LPS)、LMP組(終濃度分別為3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1)，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2中培養24 h后用于后續試驗。

1.5.4 細胞表面分子表達 BMDCs按“1.5.3”分組培養24 h后，棄上清，用預冷的PBS洗兩遍，每孔各加入1 μL CD16/CD32封閉抗體封閉，冰浴10 min 后，分別加入FITC-CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ，4 ℃避光孵育30 min后，PBS清洗兩遍，棄上清，用500 μL PBS重懸后，用NovoCyte流式細胞儀檢測。

1.5.5 細胞吞噬活性 BMDCs按“1.5.3”分組培養24 h后，棄上清，用預冷的PBS洗兩遍，加入絲裂霉素C(2 mg·mL-1)作用30 或90 min。PBS清洗兩次后，每孔各加入100 μL FITC-dextran(1 mg·mL-1)，4或37 ℃條件下避光染色1 h后，PBS清洗兩遍，棄上清，用500 μL PBS重懸后，用NovoCyte流式細胞儀檢測各個條件下的平均熒光強度(MFI)，并按下式計算細胞吞噬率。

ΔMFI(%)=MFI(37 ℃)-MFI(4 ℃)。

1.6 統計分析

2 結 果

2.1 短管兔耳草多糖的制備

由圖1A可知，經DEAE-52纖維素柱層析分離純化得到的洗脫曲線為單一峰，表明組分均一，主要分布在20～60管，因此短管兔耳草多糖的DEAE-52 纖維素色譜柱出峰時間在100～300 min。收集100～300 min內的洗脫液，經冷凍干燥后得到白色粉末狀的短管兔耳草多糖，命名為LMP。經測定，LMP的得率(18.5±1.7)%，糖含量(89.7±1.9)%，蛋白含量為(0.8±0.1)%，內毒素含量為0.011 7 EU·mL-1。

2.2 短管兔耳草多糖的結構分析

2.2.1 平均分子量 如圖1B所示，LMP在凝膠色譜柱上展現出來為單一對稱峰，峰型較寬，表明LMP的平均分子量分布較為均一。結合葡聚糖的標準曲線y=53.926 13-8.289 42x+0.529 17x2-0.015 43x3+0.000 17x4，將LMP在色譜柱的保留時間帶入標準曲線中，得到LMP的平均分子量為3.18×103u。

2.2.2 紅外光譜 如圖1C所示，LMP在3 285.14 cm-1處的吸收峰型較寬，是由O-H的伸縮振動引起，在2 930.31 cm-1和1 398.14 cm-1處的吸收峰分別代表C-H的伸縮振動和變角振動特征吸收峰，這三種吸收峰均屬于多糖的典型特征峰，表明LMP屬于多糖類物質。在1 641.13 cm-1處有一吸收峰，代表多糖官能團中O-H鍵的伸縮振動。在1 200～1 000 cm-1的吸收峰代分別代表C-O-C 和C-O-H的伸縮振動，933.49 cm-1處的吸收峰是由呋喃環伸縮振動引起的，在823.46 cm-1的吸收峰顯示其含有β-構型的糖苷鍵。

A.LMP在DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線；B.LMP在凝膠色譜柱上的平均分子量分布圖；C.LMP的紅外光譜圖; D.LMP的紫外光譜圖

2.2.3 紫外光譜掃描 LMP在200～800 nm的紫外掃描圖如1D所示，LMP在260 和280 nm處沒有明顯的吸收峰，表明LMP不含核酸和蛋白質。

2.2.4 粒徑與Zeta電位 由圖2A可知，當LMP濃度為0.1 mg·mL-1時，平均粒徑為1 483.89 nm。由圖2B可知，當LMP濃度為0.1 mg·mL-1時，溶液帶負電荷，電位值為-14.81 mV。

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A.粒徑; B.Zeta電位

2.2.5 掃描電鏡和原子力顯微鏡 圖3A為LMP的掃描電鏡圖，結果表明，在2 200的放大倍數下，樣品的表面形貌光滑，結構較為規整，呈片狀且棱角分明。圖3B為LMP的原子力顯微鏡圖像，掃描范圍為2.00 μm×2.00 μm，可看出LMP分布較均勻，其單鏈高度5.4 nm左右。

A.掃描電鏡圖；B.原子力電鏡圖

2.3 短管兔耳草多糖對BMDCs的免疫調節作用

2.3.1 BMDCs的形態學觀察 倒置顯微鏡下BMDCs的細胞形態變化如圖4所示，第1天，細胞的體積較小，呈圓形。第7天，細胞的體積變大，形態變為纖長的樹枝樣，具有較多突起，符合典型成熟DC的細胞形態。

圖4 倒置顯微鏡觀察BMDCs的細胞形態(200×)

2.3.2 短管兔耳草多糖對BMDCs增殖活性的影響 LMP對BMDCs增殖活性的影響如圖5所示，與空白組相比，0.78～100.00 μg·mL-1LMP能顯著促進BMDCs增殖(P<0.05)，以25.00 μg·mL-1LMP的增殖效果最強。當LMP的濃度為200.00～800.00 μg·mL-1時，LMP呈現一定的細胞毒性作用。因此，選擇3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-15個濃度用于后續的細胞活性評價。

小寫字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)，不同的表示差異顯著(P<0.05)。下圖同

2.3.3 短管兔耳草多糖對BMDCs表面分子表達的影響 將不同濃度的LMP(3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1)作用BMDCs 24 h后，細胞表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達情況如圖6所示。3.13～50.00 μg·mL-1LMP的CD80表達率均顯著高于空白組(P<0.05)，且呈劑量依賴性。當LMP的濃度為12.50、25.00 μg·mL-1時，CD80的表達率與LPS組相比差異不顯著(P>0.05)，3.13～6.25 μg·mL-1LMP的CD80表達率均顯著低于LPS組(P<0.05)。LMP在濃度為3.13～25.00 μg·mL-1時，CD86的表達率均顯著高于空白組(P<0.05)，以12.50 μg·mL-1LMP的CD86的表達率最高，為58.4%。3.13～50.00 μg·mL-1LMP的MHC-Ⅰ的表達率均顯著高于空白組(P<0.05)，且呈劑量依賴性。當LMP的濃度為12.50～50.00 μg·mL-1時，MHC-Ⅰ的表達率與LPS組相比差異不顯著(P>0.05)，3.13、6.25 μg·mL-1LMP的MHC-Ⅰ 表達率顯著低于LPS組(P<0.05)。12.50～50.00 μg·mL-1LMP MHC-Ⅱ的表達率均顯著高于空白組(P<0.05)，且呈劑量依賴性增長，以50.00 μg·mL-1LMP的MHC-Ⅱ表達率最高，為54.3%。

圖6 LMP對BMDCs表達CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的影響

2.3.4 短管兔耳草多糖對BMDCs吞噬功能的影響 由圖7可知，與FITC-dextran作用30 或90 min 后，LPS組和LMP組的吞噬率均顯著低于空白組(P<0.05)。與FITC-dextran作用30 min后，隨著LMP濃度的增加，吞噬率呈劑量依賴性降低。當LMP濃度為6.25、12.5 μg·mL-1時，吞噬率與LPS組相比差異不顯著(P>0.05)。當LMP濃度為25、50 μg·mL-1時，吞噬率顯著低于LPS組(P<0.05)，以50 μg·mL-1LMP的吞噬率最低，為6.1%。與FITC-dextran作用90 min后，3.13、6.25、12.50、50.00 μg·mL-1LMP的吞噬率均顯著高于LPS組(P<0.05)，而25.00 μg·mL-1LMP的吞噬率與LPS組相比差異不顯著(P>0.05)，吞噬率為10.1%。相比之下，與FITC-dextran作用30 min的吞噬率(6.1%)顯著低于作用90 min的吞噬率(10.1%)(P<0.05)。

圖7 LMP對BMDCs吞噬功能的影響

2.3.5 短管兔耳草多糖對BMDCs分泌TNF-α和IL-12的影響 LMP對BMDCs分泌細胞因子TNF-α和IL-12的影響如圖8所示。由圖8A所示，與空白組相比，3.13～50.00 μg·mL-1LMP可增加細胞因子TNF-α的分泌，以6.25 μg·mL-1LMP的TNF-α含量最高。由圖8B所示，與空白組相比，3.13～50.00 μg·mL-1LMP可顯著增加細胞因子IL-12的分泌(P<0.05)，以6.25 μg·mL-1LMP的IL-12含量最高。

圖8 LMP對BMDCs分泌TNF-α(A)和IL-12(B)的影響

3 討 論

藏藥短管兔耳草作為藏藥的常用藥材[18]，已有悠久的歷史。多糖是短管兔耳草的有效活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、免疫調節等[19-20]作用。研究表明[21]，多糖的生物活性與其結構和構像密切相關，如糖苷鍵的類型、分子量、空間構型等。不同的多糖具有不同的結構，其生物活性也具有較大差異，因此研究多糖的構效關系顯得尤為重要。

本試驗通過水提醇沉法從短管兔耳草中提取到LMP，經DEAE-52纖維素柱層析洗脫得到的洗脫曲線為單一峰，說明LMP的組分較為均一。理化性質結果顯示LMP的得率為(18.5±1.7)%，糖含量為(89.7±1.9)%，蛋白含量為(0.8±0.1)%，內毒素含量為0.011 7 EU·mL-1，說明LMP的糖含量較高、蛋白含量較低且無內毒素污染[22]，且UV光譜圖顯示在260～280 nm處未檢測到吸收峰，表明LMP不含核酸和蛋白質，這與蛋白含量測定結果一致，因此可用于后續研究。多糖分子量的大小是影響其生物活性的主要因素之一[23]，高分子量多糖因結構不均一導致活性不高，而低分子量的多糖因分子質量分布范圍小，往往表現出更高的生物活性[24]。HPGPC結果顯示,LMP的平均分子量為3.18×103u，屬于低分子量多糖，表明LMP可能具有提高生物活性的效果，這與Chandrashekar等[25]的研究結果一致。紅外譜圖顯示，LMP在多糖的特征吸收峰(3 700～3 000 cm-1和3 000～2 800 cm-1)處均有吸收峰，表明LMP屬于多糖類物質。在933.49和823.46 cm-1兩處的吸收峰分別代表是呋喃環的伸縮振動和β-構型的糖苷鍵，一般認為β構型的多糖具有較高的活性[26]，說明LMP可能具有較高的生物活性，這與Yan等[27]的研究結果一致。

粒徑的分布是反映多糖在水溶液中相互作用的重要指標之一，通常認為粒徑越小越能被機體吸收利用，從而更好地發揮藥理活性[28]。當LMP濃度為0.1 mg·mL-1時，平均粒徑較大，為1 483.89 nm，這可能與多糖的濃度有關。Zeta電位能夠通過粒子間靜電排斥作用影響粒子在分散液中的穩定性，電位的絕對值越高表明分散粒子越穩定，體系更趨于穩定[29]。LMP的Zeta電位為-14.81 mV，表明體系較為穩定。SEM和AFM用于觀察多糖的表面形貌，SEM結果顯示，LMP的表面光滑，呈片狀，棱角分明，AFM結果顯示，其單鏈的高度為5.4 nm左右。多糖分子單鏈直徑在0.1～1.0 nm[30]，而LMP的高度遠大于單鏈分子的估算值，這可能是多糖的主鏈為若干股形成或與探針的增寬效應有關。這與Li等[31]的研究結果一致。

DC是專職的APC，能夠攝取、加工處理抗原，并將處理過的抗原遞呈給T、B淋巴細胞，從而啟動免疫反應[32]。本試驗采用MTT法對BMDCs增殖活性進行了考察，3.13～50.00 μg·mL-1LMP能顯著促進BMDCs增殖，表明3.13～50.00 μg·mL-1的LMP對BMDCs來說是一個安全的劑量范圍，因此選擇3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg·mL-15個濃度用于后續試驗。

未成熟的DC低表達共刺激因子(如CD80、CD86、CD83)，但具有較強的攝取和吞噬抗原能力，成熟的DC則相反[33-34]。研究表明[35]，最能反映DC免疫功能的是MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子CD80、CD86的表達水平，它們是成熟DC的標志性分子，能識別、攝取抗原以及與它免疫細胞間信號傳遞的必要條件。在本試驗中，與空白組相比，LMP在3.13～50.00 μg·mL-1濃度均可上調CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達，且呈劑量依賴性，表明LMP可以促進BMDCs表型的成熟，以25.00 μg·mL-1LMP促進細胞表面分子(CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)表達的效果最好。吞噬活性結果發現，經LMP刺激后的BMDCs，吞噬率顯著低于空白組(P<0.05)。BMDCs與FITC-dextran作用30 min后，LMP在濃度為25.00、50.00 μg·mL-1時，降低BMDCs吞噬抗原的能力強于其他濃度組；與FITC-dextran作用90 min后，LMP在濃度為25.00 μg·mL-1時，降低BMDCs吞噬抗原的能力強于其他濃度組。因此，以25.00 μg·mL-1LMP吞噬FITC-dextran的效果最好，并以30 min的細胞吞噬率最低。

IL-12是由活化的DC、中性粒細胞和巨噬細胞產生，具有參與細胞免疫的作用[36]。IL-12和TNF-α可刺激T細胞的生長和功能的成熟，從而促進細胞免疫[37]。本研究發現，與空白組相比，3.13～50.00 μg·mL-1LMP能促進BMDCs分泌TNF-α和IL-12，說明LMP能上調BMDCs因子TNF-α和IL-12的分泌，促進BMDCs的成熟。

4 結 論

從短管兔耳草中提取得到的LMP，是一種含β-構型糖苷鍵的小分子量多糖，平均分子量為3.18×103u。該多糖能顯著促進BMDCs細胞表面分子CD80、CD86、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達，提高細胞因子TNF-α和IL-12的含量，還能降低細胞吞噬活性，表明LMP的免疫調節效果顯著。本研究可為短管兔耳草的開發及利用提供一定的理論基礎。